發(fā)布時間：2018-09-06 11:07

【摘要】：研究背景： 在近幾十年內(nèi),慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)的發(fā)病呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢,我國目前CKD患者總數(shù)已經(jīng)超過了1億,而其中尿毒癥患者占了100多萬人,同時每年以20至30萬的速度增加。目前,透析和腎移植術(shù)是治療尿毒癥的主要方法,相對于透析治療,腎移植不但能夠明顯改善患者的生活質(zhì)量,而且還能夠提高患者的存活率。然而高額的手術(shù)費用,腎源的嚴重短缺,全國每年腎移植術(shù)不足1萬例。如何更進一步提高移植腎的長期存活,如何做到對移植腎的相關(guān)病變早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療,阻斷其進一步發(fā)展,維持長期良好的移植腎功能,是擺在我們每一位腎移植臨床醫(yī)生及移植相關(guān)科研工作者面前的一個重要課題。 腎移植術(shù)作為治療終末期腎病(ESRD)的最有效的方法之一,隨著移植技術(shù)的不斷完善和新型免疫抑制劑的出現(xiàn),使得移植后急性排斥反應發(fā)生率明顯下降,腎移植病人的短期存活率有了顯著提高,人/腎1年存活率可以高達95%以上,但移植腎長期存活率提高不明顯。腎移植術(shù)后患者移植腎丟失的主要原因是：患者死亡和慢性移植腎功能不全(chronic renal allograft dysfunction, CRAD),兩者各占一半。在患者死亡的原因中常見的有：心血管疾病、肺部感染及惡性腫瘤等。CRAD已經(jīng)成為阻礙移植腎長期存活的主要原因之一。在腎移植術(shù)1年后,CRAD平均以4%-6%的速度進行性增長。 CRAD定義為：腎移植術(shù)后至少3-6月以后,特別是在術(shù)后一年或數(shù)年后出現(xiàn)的移植腎功能進行性、不可逆性的功能減退和形態(tài)學改變,最終導致移植腎功能衰竭,而不得不恢復血液透析[1],其病理變化主要表現(xiàn)為：移植腎間質(zhì)纖維化及小管萎縮(interstitial fibrosis and tubular atrophy, IF/TA)、廣泛的血管病變及腎小球硬化,臨床變現(xiàn)主要為：肌酐爬行性升高、蛋白尿和高血壓等。CRAD是一個由多種因素相互作用、序貫性發(fā)展的進行性發(fā)展過程,導致CRAD發(fā)生的病因很多,例如：腎血管性病變、移植腎本身病變以及泌尿系統(tǒng)自身疾病等,在這些眾多病因中,最常見的是移植腎自身疾病,包括免疫抑制劑的腎毒性、慢性移植腎腎病及腎臟原發(fā)性疾病復發(fā)等疾病。其他的疾病如：腎血管性病變、泌尿系梗阻等。這些危險因素可以來自供者,也可以來自受者；可以發(fā)生在腎移植后的早期,也可以發(fā)生在移植術(shù)后的晚期；可以源自患者自身,也可以源自醫(yī)源性的因素。免疫和非免疫方面的因素均可導致CRAD的發(fā)生,非免疫因素包括：糖尿病、高血壓、高脂血癥、尸體供腎、邊緣供腎、老年供腎、移植腎功能延遲恢復、蛋白尿、巨細胞病毒感染、缺血／再灌注損傷、免疫抑制劑的毒副作用(主要是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑,如：環(huán)孢素,FK506等)；免疫因素主要包括：體液免疫應答、細胞免疫應答以及HLA錯配率、急慢性排斥反應、醫(yī)院性因素(免疫抑制力不足)。其中,抗體介導的慢性排斥反應(chronic antibody-mediated rej ection, ABMR)是CRAD的免疫性因素。 機體的炎癥反應是損傷和修復的矛盾統(tǒng)一體,是一個統(tǒng)一的病理生理過程。腎臟在受到各種損傷因素的作用后,腎內(nèi)毛細血管受到刺激,發(fā)生痙攣,引起腎內(nèi)微循環(huán)受阻,腎組織發(fā)生缺血、缺氧,激活了腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞等細胞產(chǎn)生和分泌相關(guān)炎癥介質(zhì),這當中同時包含了促炎介質(zhì)以及炎癥趨化因子；同時血液中的淋巴細胞、單核細胞及巨噬細胞可通過腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷處,向腎間質(zhì)浸潤,共同加重了腎臟炎癥的發(fā)生。炎癥對腎臟的破壞作用必然導致成纖維細胞的活化,從而分泌大量的膠原纖維對損傷處進行修復,當膠原纖維的產(chǎn)生量大于降解,產(chǎn)生和降解失去平衡的時候,大量的膠原纖維沉積在腎間質(zhì),導致腎纖維化的發(fā)生。目前,對于炎癥反應在腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展中作用已經(jīng)達成以下共識：①腎臟在各種損傷刺激因素作用下,炎癥反應是早期發(fā)生的事件,炎癥反應的持續(xù)發(fā)生,最終導致腎纖維化的發(fā)生；②炎癥細胞的浸潤在腎臟纖維化的發(fā)生中起著重要的作用；③在腎纖維化的發(fā)生過程,炎癥趨化因子和炎癥因子在炎癥細胞的浸潤和慢性炎癥持續(xù)發(fā)生過程中起著關(guān)鍵因素。腎纖維化的發(fā)生目前一般劃分為三個階段：①誘導期：此期有大量的炎癥趨化因子和細胞因子的產(chǎn)生和釋放,腎臟組織學表現(xiàn)主要是單核／巨噬細胞和T淋巴細胞等炎癥細胞的浸潤和活化,同時腎間質(zhì)內(nèi)的肌成纖維細胞被激活并增殖；②腎小球系膜細胞產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)(ECM)；③ECM被降解,當出現(xiàn)ECM的合成和降解失衡時,腎臟纖維化便不可避免的發(fā)生。 有研究表明,移植腎間質(zhì)慢性炎癥反應在CRAD的發(fā)生、發(fā)展過程中起著的重要作用,慢性炎癥反應的發(fā)生是導致腎單位進行性丟失的共同的病理過程[2]。在形態(tài)學上,CRAD主要表現(xiàn)為炎癥細胞在腎間質(zhì)及腎小管的不同程度浸潤,從而導致細胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生,引起移植腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生；炎癥細胞浸潤后相關(guān)致纖維化因子的產(chǎn)生,如TIMP-1、PAI-1、PDGF及TGF-β等,這些纖維化因子共同作用于移植腎,最終導致腎纖維化。相關(guān)研究表明,單核巨噬細胞的浸潤數(shù)量與腎纖維化程度成正相關(guān),通過抑制編碼巨噬細胞生成的基因或者敲除巨噬細胞基因,發(fā)現(xiàn)腎臟纖維化的程度能得到明顯減輕[3]。在炎癥性腎臟疾病中,包括CRAD, NF-κB的活化是一個重要的細胞信號事件,它控制著一系列炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。目前,已經(jīng)有大量研究表明GSK-3β是NF-κB活化必不可少的要素[4,5]。GSK-3β是真核細胞生物體內(nèi)普遍存在的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶,它不僅調(diào)節(jié)細胞糖代謝,更重要的是能夠調(diào)節(jié)細胞分化、生長、突變以及凋亡等生命活動,并且在多種信號傳導過程中也起著重要的作用,當GSK-3β (Ser9)磷酸化為pGSK-3β(Ser9)時失活。Gong等[6]在對CRAD的研究中證實,GSK-3β在CRAD的炎癥反應發(fā)生和調(diào)節(jié)促炎癥介質(zhì)NF-K B的活化過程中起著重要的作用。GSK-3β不但能夠調(diào)節(jié)NF-κB的活化,而且是NF-κB活化必不可少的要素[7]。 可見,腎間質(zhì)纖維化是多種細胞、細胞因子、炎性介質(zhì)等諸多因子相互作用,導致ECM代謝失衡,在腎間質(zhì)異常沉所致,是一個非常復雜的過程,至今移植腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵步驟和確切發(fā)病機制尚未得到完全的闡明。 本研究主要通過免疫組化方法對ABMR導致CRAD的移植腎組織中GSK-3β、NF-κB的表達進行檢測,并分析它們與IF/TA分級的關(guān)系,探討它們在ABMR引起的CRAD發(fā)病機制中的作用,為移植腎慢性纖維化的發(fā)生和治療提供一定理論依據(jù)。 研究目的： 探討GSK-3β、NF-κB和相關(guān)炎癥性細胞因子在抗體介導的移植腎慢性排斥反應的移植腎組織中的表達情況,并分析其與腎間質(zhì)纖維化/小管萎縮(interstitial fibrosis and tubular atrophy, IF/TA)的發(fā)生的關(guān)系。探討它們在BMR引起的CRAD發(fā)病機制中的作用,為移植腎慢性纖維化的發(fā)生和治療提供一定的理論依據(jù)。 研究方法： 1.病例入選標準 腎移植術(shù)3個月后,不明原因的血肌清酐異常升高130μmol/L;肌酐升高后,給予甲潑尼龍500mg/L連續(xù)3天沖擊治療,肌酐無明顯降低者,排除急性排斥反應,同時予以ACEI類藥物降壓及活血護腎等處理,復查均未見好轉(zhuǎn)；彩超檢查排除了輸尿管梗阻(結(jié)石、腫瘤及外源性壓迫等)及移植腎動脈狹窄；鈣調(diào)神經(jīng)蛋白酶抑制劑(環(huán)孢素、他克莫司)濃度維持在正常范圍內(nèi)；T淋巴細胞亞群檢測未見明顯升高；移植腎病理檢查見移植腎間質(zhì)呈慢性改變,如：腎小管周圍毛細血管基底膜增厚、腎小球基底膜增厚(可見假雙軌征)；間質(zhì)纖維化/小管萎縮；動脈內(nèi)膜增厚。 2.臨床資料 收集桂林解放軍第181醫(yī)院2002年01月至2013年04月住院的腎移植病人116例,其中尸體供腎98例,活體供腎8例,供受者腎移植術(shù)前均行乙肝、丙肝標志物檢查為陰性,且術(shù)后復查亦均為陰性。術(shù)后出現(xiàn)肌酐爬行升高,蛋白尿,且反復定性檢查呈陽性(++～++++),定量檢查均≥0.20g/24h,予以ACEI類降壓、活血護腎等處理,復查均未好轉(zhuǎn)。行移植腎穿刺病理活檢術(shù),按照Banff2009移植腎病理分級診斷標準[8],病理診斷為抗體介導的移植腎慢性排斥反應,包括65例男性,(48±11)歲；51例女性,(42±8)歲,腎穿時間為腎移植術(shù)后0.3～13.6年,血肌酐(563±137) μmol/l。其中,58例接受環(huán)孢素+嗎替麥考酚酯+潑尼松三聯(lián)免疫抑制治療方案,58例接受他克莫司+嗎替麥考酚酯+潑尼松三聯(lián)方案治療。所有供、受者血型相同,抗供者特異性抗體(DSA)檢測陰性,群體反應性抗體(PRA)10%,淋巴細胞毒交叉配型試驗(CDC)10%, HLA-A、 HLA-B、HLA-Dr位點至少有二個位點相配。以10例正常腎組織零點穿刺標本作為對照組,病理檢查無異常,年齡19-53歲。 3.研究方法 用免疫組織化學En Vision二步法檢測移植腎組織中GSK-3β是NF-κB、 MCP-1、RANTES的表達,采用德國Leica (DMR+Q550型)真彩色病理圖像分析系統(tǒng)對染色結(jié)果進行半定量分析,隨機選取10個不連續(xù)(避開腎小球和大血管)的腎小管間質(zhì)視野(×400,HPF),每例腎小管總數(shù)大于60個。使用ImagePro-Plus6.0軟件計算平均光密度,取其均值表示該種成分在腎小管和間質(zhì)的相對含量。 4.診斷及分類標準 依據(jù)Banff2009移植腎病理分級診斷標準[8],將移植腎間質(zhì)纖維化/小管萎縮(IF/TA)的嚴重程度分為：Ⅰ級輕度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(25%的皮質(zhì)受累)；Ⅱ級中度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(26%-50%的皮質(zhì)受累)；Ⅲ級重度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(50%的皮質(zhì)受累)。 ABMR診斷標準[8]:C4d陽性,循環(huán)中存在抗供者抗體(DSA),慢性組織損傷的形態(tài)學證據(jù),如腎小球基底膜(GBM)雙軌征和(或)小管周圍毛細血管基底膜多層和(或)間質(zhì)纖維化/小管萎縮和(或)動脈纖維性內(nèi)膜增厚。 腎小管間質(zhì)炎癥細胞浸潤程度分度：輕度少量散在炎癥細胞浸潤；中度炎癥細胞呈局灶性浸潤；重度大片、彌漫性炎癥細胞浸潤。 統(tǒng)計分析： 數(shù)據(jù)均數(shù)±標準差(x±s)表示,應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料采用one way ANOVA,兩兩比較用LSD法(t檢驗)；兩變量相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析；不同治療方案中的差異比較用獨立樣本t檢驗,P0.05有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.組織學觀察 HE染色下移植腎組織學改變主要表現(xiàn)：小球系膜基質(zhì)增寬,間質(zhì)有灶性單核細胞浸潤；PASM染色可見：系膜細胞及基質(zhì)中-重度增生,局部包曼氏囊壁增厚、分層,基底膜增厚,基底膜呈連環(huán)樣改變和假雙軌征；Masson染色組織學表現(xiàn)為：小球呈節(jié)段硬化,包蔓氏囊增厚、分層,間質(zhì)中度纖維化伴有炎癥細胞浸潤,小管上皮萎縮。 不符合急性排斥反應、免疫抑制劑慢性腎毒性損傷、慢性腎小球腎炎等其他腎病病理改變。 2.C4d的表達 正常腎組織中C4d主要表達于的腎小球、腎小管基底膜及系膜區(qū),而在正常腎組織腎小管周圍毛細血管(PTC)的內(nèi)皮細胞中未發(fā)現(xiàn)C4d沉積；在ABMR移植腎組織標本中,C4d呈陽性表達,主要表達于PTC的內(nèi)皮細胞((?)50%)。 3. GSK-3β的表達 在正常腎組織中,GSK-3β表達較低或無。在ABMR患者移植腎組織中,GSK-3β的表達顯著增加,主要表達于腎小管細胞胞漿中。隨著GSK-3β平均光密度的增加IF/TA分級、NF-κB p65、RANTES和MCP-1平均光密度亦增大,呈正相關(guān),表示其表達水平亦隨之增加。GSK-3β的表達同炎癥細胞浸潤亦具有正相關(guān)性。 4. NF-κB p65的表達 正常腎組織中可在腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞偶見NF-κB p65表達。在ABMR患者移植腎組織中,NF-κB p65主要表達在包曼氏囊上皮細胞、系膜細胞和腎小管上皮細胞,表達水平較對照組明顯增加,其表達水平同炎癥性細胞因子RANTES、MCP-1及IF/TA病理分級呈正相關(guān)；NF-κB p65的表達同炎癥細胞浸潤亦具有正相關(guān)性。 5. RANTES的表達 正常腎組織中的RANTES表達量低或無。在ABMR患者移植腎組織中RANTES大量表達于腎小管上皮細胞、腎小球系膜區(qū)及腎間質(zhì)內(nèi)的單核巨噬細胞,血管內(nèi)皮細胞亦可見RANTES陽性細胞。腎小管損傷愈嚴重、間質(zhì)炎癥細胞浸潤愈多的部位,表達愈強。并且RANTES的表達隨著間質(zhì)纖維化/小管萎縮的程度加重而增多,具有正相關(guān)性；RANTES的表達同炎癥細胞浸潤亦具有正相關(guān)性。 6.MCP-1在腎組織中的表達和血清肌酐水平 正常腎組織中MCP-1表達較少。而在ABMR患者移植腎組織中,MCP-1表達顯著增加,主要位于腎小管上皮細胞胞漿、腎小球系膜區(qū)及毛細血管袢內(nèi)皮側(cè),MCP-1與IF/TA病理分級亦呈正相關(guān)。ABMR患者血清肌酐升高的水平同纖維化程度分級的增加一致；MCP-1的表達同炎癥細胞浸潤亦具有正相關(guān)性。 7. GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1在不同免疫抑制方案組間的表達情況 在環(huán)孢素和他克莫司兩種為主的免疫抑制劑方案組之間GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1的表達無均無明顯統(tǒng)計學差異。 8. ABMR患者移植腎組織中GSK-3β的表達同NF-κBp65、RANTES和MCP-1的關(guān)系 在正常腎組織中,GSK-3β表達較低或無。在ABMR患者移植腎組織中,GSK-3β的表達顯著增加,主要表達于腎小管細胞胞漿中。隨著GSK-3β平均光密度的增加NF-κB p65、RANTES和MCP-1平均光密度亦增大,呈正相關(guān)(r分別為0.812、0.804和0.788, P0.001)。 9. GSK-3β、NF-κBp65、RANTES和MCP-1的表達同腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤的關(guān)系 隨著移植腎間質(zhì)中GSK-3β、NF-κkB p65、RANTES和MCP-1的表達表達水平的增加,間質(zhì)中炎癥細胞浸潤程度也加重,兩者呈正相關(guān)(r分別為0.905、0.868、0.931和0.897,P0.001)。 10. GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1的表達同IF/TA病理分級的關(guān)系 隨著間質(zhì)纖維化/小管萎縮的程度加重,GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1的表達亦隨之而增多,具有正相關(guān)性(r分別為0.884、0.914、0.888和0.868,P0.001)。 11. GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1在不同免疫抑制方案組間的表達情況 在環(huán)孢素和他克莫司兩種為主的免疫抑制劑方案組之間GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1的表達無均無明顯統(tǒng)計學差異(P分別為：0.137、0.197、0.578、0.140)。 結(jié)論： 1.在抗體介導的慢性排斥反應患者移植腎組織中,移植腎病理組織學改變主要為：小球系膜基質(zhì)增寬,間質(zhì)有灶性單核細胞浸潤；PASM染色可見：系膜細胞及基質(zhì)中-重度增生,局部包曼氏囊壁增厚、分層,基底膜增厚,基底膜呈連環(huán)樣改變和假雙軌征；Masson染色組織學表現(xiàn)為：小球呈節(jié)段硬化,包蔓氏囊增厚、分層,間質(zhì)中度纖維化伴有炎癥細胞浸潤,小管上皮萎縮。 不符合急性排斥反應、免疫抑制劑慢性腎毒性損傷、慢性腎小球腎炎等其他腎病病理改變。 2. GSK-3β的表達同NF-κBp65、 RANTES和MCP-1的表達呈現(xiàn)正相關(guān)性。 3. GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1在ABMR患者移植腎組織中的表達較正常組顯著升高,并且隨著IF/TA分級的增加呈現(xiàn)出逐漸增多。 4. GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1在ABMR移植腎組織中的表達隨著間質(zhì)中炎癥細胞浸潤的增多表達而增加。 5. GSK-3β和NF-κB p65的表達異常增高同移植腎間質(zhì)纖維化/小管萎縮、慢性移植腎失功的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R699.2

【參考文獻】

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1 丁鶴林 ,黎鋒 ,徐明彤 ,程樺 ,傅祖植 ,鄧慶麗 ,鄧詣群 ,朱振宇 ,王佑民;抑制核因子-κB對糖尿病腎病的作用[J];中華內(nèi)科雜志;2002年09期

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本文編號：2226163