發(fā)布時間：2018-09-06 08:08

【摘要】：心腎綜合征(cardiorenal syndrome, CRS)是指患者同時存在心功能不全和腎損害,且兩者之間存在復(fù)雜相互作用的臨床綜合征。心臟疾病對腎功能有多方面的損害,腎功能不全也會顯著損害心功能,最終導(dǎo)致心腎衰竭。CRS包括不同的心臟和腎臟的病理生理障礙,任一器官的急慢性功能障礙均可導(dǎo)致另一器官的急慢性功能障礙3。CRS的原發(fā)性受損器官可以是心臟也可以是腎臟。導(dǎo)致心腎同時出現(xiàn)損傷和/或功能障礙的全身狀態(tài)也是CRS的亞型之一3。隨著心、腎功能疾病發(fā)生率的與日俱增,CRS的發(fā)生呈逐年增加趨勢,是臨床亟待解決的重要課題。目前對CRS的認識和防治尚未取得顯著進展,給CRS的防治帶來了極大的障礙。深入探討CRS病理生理機制對防治CRS具有重要的基礎(chǔ)理論和臨床指導(dǎo)價值。 心腎相互作用是CRS發(fā)生的關(guān)鍵,其病理生理機制尚未闡明。CRS各分型之間在病理機制上存在一些共同特征：原發(fā)衰竭器官導(dǎo)致一系列反應(yīng)機制如神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)包括交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血流動力學(xué)紊亂、高血壓等通過介導(dǎo)心肌細胞纖維化、心肌肥大、腎間質(zhì)細胞纖維化、腎小球硬化等病理生理機制的激活。這些機制可能在早期階段發(fā)揮一定的代償作用,但從長遠來看最終將導(dǎo)致心腎功能衰退,或者在最初就引發(fā)另一器官的繼發(fā)性功能失調(diào)。近年來,針對以上病理生理機制,采用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors, ACEI)、血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin receptor antagonism, ARB)、醛固酮受體拮抗劑(aldosterone receptor antagonist, MR)、β-'腎上腺素受體阻滯劑以及血液透析等措施防治心、腎功能衰竭的療效已被臨床和基礎(chǔ)研究證實,但仍未能阻止CRS的發(fā)生發(fā)展,提示可能存在其它機制導(dǎo)致心腎交互損害,促進CRS的發(fā)生發(fā)展。 尿毒癥毒素在CRS中的作用日益受到重視,尤以硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate, IS)的作用最為突出。已有研究認為IS(1)主要由腎臟清除,難以通過透方式析清除；(2)劑量依賴性促大鼠心肌纖維母細胞纖維化和心肌細胞肥大作用；(3)促進遠端腎小管損傷、腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化、以及腎組織超氧化物清除能力降低,加劇腎功能損傷等作用。因此,目前認為IS具有導(dǎo)致心腎交互損害的基本特征。然而,已有研究存在的問題是：IS與CRS患者心功能衰竭的具體關(guān)系尚未明確,IS促進心肌肥大、心肌成纖維細胞纖維化等作用機制尚未闡明。對上述問題的闡明將有助于明確IS在CRS中的作用,并未進一步篩選治療靶點提供依據(jù)。為解決上述問題,本研究將以下幾個方面展開： 第一章外周血硫酸吲哚酚與心腎綜合征患者心功能的關(guān)系研究 研究目的：臨床試驗入手探討IS與CRS心功能損傷的關(guān)系。 研究方法：選擇20011年11月至2012年12月在我院檢查及治療的年齡在(30-70)歲的CRF患者共90例,其中男性53例,女性37例。入選對象需滿足以下條件：(1)簽署知情同意書；(2)腎小球濾過率(Glomerular Filtration Rate, GFR)15ml/min·1.73m2≥3個月,有或無腎臟損傷的證據(jù)；(3)藥物、血液透析獲采取任何治療方式；(4)符合Ronco3等總結(jié)的CRS診斷標(biāo)準；(5)排除：心臟瓣膜病、風(fēng)濕性疾病、肥厚型心肌病、擴張型心肌病、限制型心肌病、感染性心內(nèi)膜炎、縮窄性心包炎、先天性心臟病、腫瘤、甲狀腺功能亢進。抽取患者空腹靜脈血10ml,其中7ml靜脈血送珠江醫(yī)院檢驗科行血常規(guī)、生化等指標(biāo)檢測,剩余3ml靜脈血標(biāo)本,用于高效液相色譜-熒光檢測法對硫酸吲哚酚含量進行測定分析。利用MDRD公式計算GFR對腎功能進行評價。心臟超聲對患者心臟結(jié)構(gòu)和功能等相關(guān)指標(biāo)進行檢測。依據(jù)IS水平將所有研究對象分為高IS組和低IS組。 結(jié)果：通過對CRF患者外周血IS濃度、臨床基本資料、心臟超聲等指標(biāo)進行檢測分析,發(fā)現(xiàn)：高IS組(IS35ng/dL)在冠心病占人群比例、肌酐、GFR、BNP、LVPW、E/e'等較低IS組升高有顯著性意義。進一步利用簡單線性回歸分析顯示IS濃度水平可能與性別、NYHA分級、高脂血癥、冠心病、腦梗死、糖尿病、服用抗血小板藥物、利尿劑、他汀類藥物、GFR、BNP、LVDd、IVST、 LVEF、LVMI、DCT、E/e'等因素相關(guān)。為進一步明確IS的影響,我們還利用多元線性回歸逐步分析,結(jié)果顯示利尿劑、GFR, BNP、LVEF、LVMI以及E/e’可明顯影響IS濃度變化；其中利尿劑、BNP、LVMI以及E/e’可能是IS的正相關(guān)影響因素,GFR, LVEF可能是IS的負相關(guān)影響因素。 結(jié)論：CRF患者體內(nèi)IS蓄積與心腎功能相關(guān)。為明確IS是否發(fā)揮CRS導(dǎo)致心功能損傷的橋梁作用,我們將利用動物模型進行進一步研究。 第二章硫酸吲哚酚與CRS大鼠模型心功能的關(guān)系研究 研究目的：通過動物實驗進一步證實IS與CRS心功能損傷的關(guān)系。研究方法：選用雄性SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham+Sham)、心肌梗死組(MI+Sham)、STNx組(Sham+STNx)以及心肌梗死+STNx組(MI+STNx)。采用無創(chuàng)血壓監(jiān)測系統(tǒng)對大鼠血壓進行監(jiān)測,超聲心動圖對大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能進行檢測,計算大鼠GFR,以HPLC-FLU法對大鼠血清IS含量,對大鼠梗死面積,非梗死區(qū)域間質(zhì)纖維化,心肌細胞肥大等相關(guān)指標(biāo)進行檢測,采用定量PCR法對大鼠非梗死組織miR-34a表達進行檢查。 結(jié)果： 1建模后大鼠生存率和梗死面積比較 假手術(shù)組(Sham+Sham)、心肌梗死組(MI+Sham)、STNx組(Sham+STNx)以及心肌梗死+STNx組(MI+STNx)大鼠生存率分別為100%、59.7%、91.7%和44.1%。心肌梗死組和心肌梗死+STNx組的大鼠心肌梗死面積比較,差異無顯著性意義。 2各組大鼠血壓比較 14周后STNx組、MI+STNx組較其它兩組大鼠血壓升高有顯著性意義；其中MI+STNx組大鼠收縮壓較STNx組降低有顯著性意義(P0.05)。 3心臟組織重量 MI+STNx組大鼠的心臟體重比和左室體重比高于MI+Sham組大鼠有顯著性意義；Sham+STNx組大鼠心臟體重比和左室體重比較MI+Sham組增加有顯著性意義(P0.01)。 4心臟超聲檢查結(jié)果 MI+Sham組和MI+STNx組大鼠心臟LVEF較其它兩組降低有顯著性意義,其中MI+STNx組較MI+Sham組的大鼠心臟LVEF降低有顯著性意義(P0.001)。Sham+STNx組LVMI和E/e’較其它三組升高有顯著性意義(P0.001)。 5血流動力學(xué)變化 與MI+Sham組相比,MI+STNx組大鼠收縮壓、舒張壓以及LVEDP升高(P0.05),CO降低(P0.05)。與Sham+Sham組相比,MI+Sham組和MI+STNx組的dP/dt max和dP/dt min減少有顯著性意義(P0.05)；但MI+Sham組和MI+STNx組兩組在dP/dt max和dP/dt min指標(biāo)上相比,差異無顯著性意義(P0.05)。與Sham+Sham組相比,收縮功能相關(guān)指標(biāo)如PRSW和ESPVR在MI+Sham組和MI+STNx組減少有顯著性意義(P0.05)。 6心肌間質(zhì)纖維化 天狼猩紅染色結(jié)果顯示：與Sham+Sham組相比,其余3組左室非梗死區(qū)心肌間質(zhì)纖維化增加有顯著性意義(P0.01)；與MI+Sham組相比,MI+STNx組左室非梗死區(qū)心肌間質(zhì)纖維化增加有顯著性意義(P0.01)。 7心肌細胞橫截面積 根據(jù)HE染色結(jié)果,與MI+Sham組相比,在MI+STNx組的左室非梗死區(qū)域心肌細胞橫截面積升高有顯著性意義(P0.05)；與Sham+Sham組相比,心肌細胞橫截面積在MI+Sham組和Sham+STNx組升高有顯著性意義(P0.05)。 8腎功能和血漿IS水平 與Sham+Sham組和MI+Sham組相比,Sham+STNx組和MI+STNx組大鼠GFR降低,CrCl、血肌酐水平、IS含量升高等有顯著性意義(P0.01)。 9Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白以及miR-34a的表達 免疫組織化學(xué)染色分析顯示大鼠心肌非梗死區(qū)域Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的表達在STNx+MI組和Sham+STNx組較Sham+Sham組和Sham+MI組增強有顯著性意義(P0.05)；定量PCR檢測結(jié)果顯示大鼠心肌非梗死區(qū)域miR-34a的表達在STNx+MI組和Sham+STNx組較Sham+Sham組和Sham+MI組增強有顯著性意義(P0.05)；Ⅲ型膠原蛋白的表達和miR-34a在STNx+MI組較Sham+STNx組升高有顯著性意義(P0.05)。 10miR-34a與IS、心肌肥大和心肌纖維化的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示非梗死區(qū)域miR-34a表達與大鼠外周血肌酐(r=0.881,P0.001)、LVEDP(r=0.746, P0.001)、心肌間質(zhì)纖維化面積(r=0.897,P0.001)、心肌細胞橫截面積(r=0.834,P0.001)、膠原蛋白Ⅰ(r=0.927,P0.001)、膠原蛋白Ⅲ(r=0.911,P0.001)、外周血IS含量(r=0.903,P0.001)正相關(guān),與-dP/dtmin (r=-0.417, P=0.018)、PRSW (r=-0.658, P0.001)、GFR (r=-0.938,P0.001)、肌酐清除率(r=-0.944,P0.001)負相關(guān)；提示miR-34a可能參與了IS介導(dǎo)CRS心功能衰竭的病變進程。 結(jié)論：本章研究利用大鼠心肌梗死+STNx建立CRS模型證實IS與心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞纖維化、以及心腎功能損傷密切相關(guān)。該模型初步證實MI+STNx可以使大鼠心腎功能惡化、心肌重塑加劇。miR-34a可能參與了IS介導(dǎo)CRS心功能衰竭的病變進程。 第三章miR-34a在硫酸吲哚酚促心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞纖維化中的作用 研究目的：明確miR-34a與IS促心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞纖維化作用之間的關(guān)系。 研究方法：首先分離培養(yǎng)乳鼠心肌細胞(newborn mice cardio-myocytes,NCMS)和乳鼠成纖維細胞(newborn mice cardio-fibroblasts, NCFs)。分別構(gòu)建miR-34a過表達載體和抑制表達載體,轉(zhuǎn)染根據(jù)實驗設(shè)計分為以下幾組,即對照組、IS組、anti-miR-34a+IS組、miR-34a組以及miR-34a+IS組。其中對照組不給予任何干預(yù)措施,IS組給予IS刺激,anti-miR-34a+IS組在anti-miR-34a轉(zhuǎn)染NCMs、NCFs基礎(chǔ)上予以IS刺激,miR-34a組僅給予以miR-34a轉(zhuǎn)染NCMs、 NCFs,miR-34a+IS組則在miR-34a組基礎(chǔ)上予以IS刺激。IS刺激終濃度為20μM。48小時候后收集NCMs、NCFs,抽提RNA用于Real time PCR檢測以及提取蛋白用于western blotting檢測蛋白表達水平,以及3H標(biāo)記亮氨酸法檢測NCMs巴大和NCFs纖維化。 結(jié)果： 1各組細胞miR-34a的表達 在NCMs各組細胞中miR-34a的表達有顯著性意義(F=199.976,P0.001),在NCFs各組細胞中miR-34a的表達有顯著性意義(F=482.752,P0.001)。相對于對照組,NCMs和NCFs的IS組中miR-34a的表達倍數(shù)約分別升高2.15倍和1.91倍(P0.001)；NCMs和NCFs的miR-34a組中miR-34a的表達倍數(shù)約分別升高2.63倍和2.44倍(P0.001),NCMs和NCFs的anti-miR-34a組中miR-34a的表達倍數(shù)約分別為對照組的0.61倍和0.73倍(P0.001), NCMs和NCFs的IS+anti-miR-34a組中miR-34a的表達倍數(shù)約分別為對照組的0.78倍和0.74倍(P0.001)。 2IS及miR-34a對NCMs、NCFs3H標(biāo)記亮氨酸攝取率的影響 NCMs、NCFs3H標(biāo)記亮氨酸攝取率在5組間相比,差異有顯著性意義(P0.001)；與其它三組相比,miR-34a組最多(P0.001)；Anti-miR-34a組最少(P0.05)；以上結(jié)果提示miR-34a可促進NCMs、NCFs3H標(biāo)記亮氨酸攝取率。見表3-2。 3IS及miR-34a對NCMs、NCFs各組Notch-1蛋白表達的影響 Western blotting檢測顯示與對照組相比,IS組和miR-34a組Notch-1蛋白表達下調(diào),anti-miR-34a組和IS+miR-34a組Notch-1表達上調(diào),提示miR-34a可能通過上調(diào)miR-34a表達進而抑制Notch-1的表達。 結(jié)論：IS可能通過miR-34a促進心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞纖維化；這種作用可能部分通過作用于Notch-1實現(xiàn)的。 通過上述各部分實驗,我們能夠得出以下結(jié)論： (1)CRF患者體內(nèi)IS蓄積與心腎功能明顯相關(guān)。 (2)本章研究利用大鼠心肌梗死+STNx建立CRS模型證實IS與心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞纖維化、以及心腎功能損傷密切相關(guān)。miR-34a可能參與了IS介導(dǎo)CRS心功能衰竭的病變進程。 (3)IS可能通過miR-34a促進心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞纖維化；這種作用可能部分通過作用于Notch-1實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R541;R692
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本文編號：2225745