發(fā)布時間：2020-12-04 12:13

　　近年來人們發(fā)現(xiàn)了許多神經(jīng)保護(hù)短肽具有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用,而且它們的分子量小,能夠自由通過血腦屏障,在AD等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中具有廣闊的前景。然而神經(jīng)保護(hù)短肽在臨床應(yīng)用中普遍存在著半衰期短,人工合成的價格昂貴等問題。為了能將神經(jīng)短肽用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療,本研究構(gòu)建了攜帶融合基因NT4-NAP的慢病毒載體,實現(xiàn)了神經(jīng)保護(hù)短肽NAP在體內(nèi)的持續(xù)分泌表達(dá),通過體外細(xì)胞學(xué)實驗和閉合性腦損傷動物模型證實了可分泌表達(dá)NAP的重組慢病毒具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用。為了實現(xiàn)重組慢病毒能在體內(nèi)持續(xù)分泌表達(dá)的目的和證實其神經(jīng)保護(hù)作用,本研究進(jìn)行了以下實驗:1、構(gòu)建分泌表達(dá)NAP的重組慢病毒采用PCR方法,克隆了融合基因NT4-NAP cDNA,應(yīng)用重組病毒包裝技術(shù)構(gòu)建了可分泌表達(dá)神經(jīng)保護(hù)肽NAP的重組慢病毒。2、建立APPsw轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)突變β淀粉樣肽前體蛋白APPsw基因。3、通過體內(nèi)外實驗驗證可分泌表達(dá)NAP的重組慢病毒的神經(jīng)保護(hù)作用①選用構(gòu)建的AD細(xì)胞模型,體外感染重組慢病毒rLent/NT4-NAP,通過RT-PCR檢測NT4-NAP基因在細(xì)胞內(nèi)... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：127 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

VIP刺激膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)3．NAP

該外殼蛋白與細(xì)胞表面受體的識別決定了病毒顆�？赊D(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞且這些外殼蛋白就是根據(jù)相對應(yīng)的細(xì)胞表面受體進(jìn)行分類的[61]。逆轉(zhuǎn)錄病毒生活周期的第一階段是病毒整合入細(xì)胞基因組，導(dǎo)致前的建立。逆轉(zhuǎn)錄病毒生活周期的第二階段是新病毒顆粒的裝配和釋毒的結(jié)構(gòu)基因編碼合成病毒蛋白，與轉(zhuǎn)錄出的病毒基因組 RNA 裝的病毒顆粒，在細(xì)胞的表面以出芽方式釋放。（見圖 1-2）

多克隆位點、目的基因、選擇標(biāo)志基因取代，僅保留 LTR 及病毒包裝信 序列。2）組建包裝細(xì)胞系。對于病毒顆粒構(gòu)建、識別等過程所必須的 gag、 env 基因整合在包裝細(xì)胞的基因組內(nèi)。3）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝、收集。將含有目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞獲得可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，用抗性標(biāo)記篩選穩(wěn)定的細(xì)胞株。（見圖 1-3）4）轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，進(jìn)行蛋白表達(dá)。用所得缺陷型重組病毒感染靶細(xì)胞，隨病毒 DNA 的整合，目的基因也整合到靶細(xì)胞基因組中并進(jìn)行表達(dá)，完因轉(zhuǎn)移。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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