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核糖體蛋白RPL41調(diào)節(jié)ATF4在卵巢癌中的作用及其機制

發(fā)布時間:2020-11-18 05:37
   研究背景及目的:卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤,起病隱匿,死亡率高。嚴重威脅是女性健康。與正常組織相比較,ATF4在腫瘤組織中的表達高,腫瘤微環(huán)境(如缺氧/無氧、氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等)信號可以上調(diào)其表達。目前發(fā)現(xiàn),ATF4與腫瘤細胞的生長轉(zhuǎn)移,侵襲和耐藥等信號通路有關。ATF4能夠與VEGF-A、uPA基因的啟動子區(qū)域相結(jié)合,增強其轉(zhuǎn)錄活性來上調(diào)二者表達;而目前表明VEGF-A和uPA基因在卵巢癌的生長及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著十分重要的作用。核糖體蛋白RPL41(Ribosomal protein L41,RPL41),由25個氨基酸組成小分子多肽。目前研究表明rpl41表達的下調(diào)與多種腫瘤細胞有關。課題組前期研究表明RPL41能夠誘導ATF4磷酸化,轉(zhuǎn)移到蛋白酶體內(nèi)迅速降解。而RPL41分子量小,可以自由穿過細胞膜,具有成為藥物的先天優(yōu)勢。在本次研究中,我們使用小分子胎RPL41誘導ATF4表達下調(diào),探討RPL41對于卵巢癌細胞的抑制作用及其機制,在為卵巢癌的治療提供新的靶點。研究方法:1.RPL41對OC細胞系A2780及CAOV3細胞的抑制作用,并觀察RPL41引起卵巢癌細胞凋亡的形態(tài)學改變以及對OC細胞周期的影響(1)利用CellTiter-Glo?熒光細胞活性檢測系統(tǒng)觀察RPL41對細胞的作用。(2)采用Hoechst熒光染色法觀察A2780及CAOV3細胞凋亡的形態(tài)學變化。(3)利用流式細胞儀測定不同濃度RPL41干預后,A2780細胞、CAOV3細胞細胞周期與凋亡情況2.細胞劃痕試驗和Transwell侵襲小室實驗研究RPL41對A2780及CAOV3細胞的遷移及侵襲能力的影響。(1).細胞劃痕試驗觀察RPL41對A2780細胞、CAOV3細胞遷移能力的影響(2)侵襲小室實驗觀察RPL41對A2780細胞、CAOV3細胞侵襲能力的影響3.研究RPL41抑制細胞生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機制。(1).雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)研究卵巢癌細胞中ATF4對VEGF-A和uPA啟動子的調(diào)控作用。(2).應用Western blot及RT-PCR技術驗證RPL41誘導的ATF4降解是否能夠下調(diào)VEGF-A及uPA基因的表達。結(jié)果:Hoechst熒光染色及Annexin-V/Pl雙染檢測A2780細胞、CAOV3細胞凋亡結(jié)果顯示:不同濃度RPL41作用24h后,隨著RPL41作用濃度的增加,細胞凋亡率增加,細胞形態(tài)出現(xiàn)改變,在RPL41濃度大于100μM時,差異有統(tǒng)計學差異(p0.05)。而作用48h后,細胞凋亡趨勢并不明顯,無統(tǒng)計學差異。CellTiter-Glo?實驗結(jié)果表明,細胞活性隨著RPL41作用濃度的增加,作用時間的延長而降低。劃痕實驗及侵襲小室實驗研究結(jié)果表明RPL41可以有效抑制卵巢癌細胞A2780、CAOV3的遷移和侵襲能力,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng),研究結(jié)果顯示ATF4對VEGF-A和uPA啟動子具有調(diào)控作用,而Western blot及RT-PCR結(jié)果顯示:ATF4,VEGF-A和uPA隨著RPL41濃度的增高,表達降低。結(jié)論:1.RPL41誘導OC細胞產(chǎn)生形態(tài)學變化,抑制其生長,促進細胞凋亡,并且作用于G2-M期。2.RPL41抑制A2780及CAOV3細胞的遷移及侵襲能力3.RPL41誘導ATF4下調(diào),進而對VEGF-A及uPA啟動子進行調(diào)控4.RPL41可以作為敲低ATF4的媒介
【學位單位】:中國醫(yī)科大學
【學位級別】:碩士
【學位年份】:2018
【中圖分類】:R737.31
【部分圖文】:

細胞形態(tài)學,依賴性


圖 1. Hoechst 檢測 CAOV3 及 A2780 細胞形態(tài)學變化A: 24h 時,A2780 細胞隨著 RPL41 濃度的升高而出現(xiàn)細胞核碎裂,濃度越高明顯,存在計量依賴性。而 48 小時也出現(xiàn)和碎裂現(xiàn)象,但無明顯計量依賴性CAOV3 細胞隨著 RPL41 濃度的升高而出現(xiàn)細胞核碎裂,濃度越高,細胞凋亡計量依賴性。而 48 小時也出現(xiàn)和碎裂現(xiàn)象,但無明顯計量依賴性。

細胞凋亡,流式細胞技術,雙熒光,周期


中國醫(yī)科大學碩士學位論文.3 Annexin V /PI 雙熒光染色檢測細胞凋亡與周期結(jié)果本實驗采用 Annexin V /PI 雙熒光染色的法來檢測卵巢癌細胞的凋亡情況結(jié)果顯示: 在 RPL41 濃度分別為 0,20,40,60,80,100μM 時,在作用時的凋亡率分別為:8.5,8.15,17.2,17.42,20.61and 22.03%。而在 RPL41 8 小時的凋亡率確是:6.5,6.6,7.88,9.74,10.14 and 12.38%。實驗結(jié)果表 24 小時的時候,隨著 RPL41 濃度的增加,細胞的凋亡率是隨之增加的,且大于 100 μM 時具有統(tǒng)計學意義(p<0.05), 在 48 小時的時候,細胞的凋亡率4 小時反而降低,且組間未見明顯差異,無統(tǒng)計學意義 (圖.3)

遷移能力,細胞侵襲,細胞的,細胞遷移


中國醫(yī)科大學碩士學位論文4.5 Transwell 侵襲實驗檢測 RPL41 對 CAOV3 及 A2780 細胞侵襲能力的抑制能力。實驗結(jié)對照組細胞侵襲能力較強,而 RPL41 作用組,細胞侵襲能力相對較弱。且具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),這表明 RPL41 對卵巢癌細胞 CAOV3 及 A2780力具有抑制作用(如圖:5)。
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