背景甲狀腺激素參與調(diào)節(jié)機體的各種生理功能和病理過程,包括參與碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類的代謝,影響細胞的增殖和發(fā)育,調(diào)節(jié)對其他激素的反應(yīng)。甲狀腺功能減退可引起全身各系統(tǒng)新陳代謝水平下降,生理功能減退。研究表明甲狀腺功能減退癥與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)密切相關(guān),被認為是胰島素抵抗的危險因素。近期的研究也發(fā)現(xiàn)即使在甲狀腺功能正常的人群,機體甲狀腺激素生理范圍內(nèi)的波動也與胰島素分泌及其敏感性有關(guān)。同樣在圍產(chǎn)期間,妊娠期未控制的甲狀腺功能紊亂與不良的產(chǎn)科和胎兒結(jié)局有關(guān),會影響子代的生長以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。近年研究還發(fā)現(xiàn),甲狀腺功能減退對于母親和子代的糖代謝均有不利影響,但其機制尚不十分清楚。IR分為外周型IR以及肝型IR。外周型IR主要特征在于肌肉組織的葡萄糖攝取和利用異常以及脂肪組織中脂解作用增加,最終游離脂肪酸釋放增加。骨骼肌組織是糖脂代謝的重要場所,負責(zé)機體約70%-80%的葡萄糖代謝,在全身的能量代謝中發(fā)揮重要作用,所以骨骼肌IR的發(fā)生發(fā)展促進了整個機體IR的進展。近年來關(guān)于骨骼肌IR發(fā)生的生物學(xué)機制已有許多研究,主要包括:骨骼肌線粒體功能缺陷、骨骼肌脂質(zhì)沉積和炎性反應(yīng)。骨骼肌組織脂質(zhì)沉積,如甘油三酯(TG)、游離脂肪酸等脂質(zhì)的堆積,從而影響胰島素信號傳導(dǎo)通路,最終誘導(dǎo)骨骼肌乃至全身胰島素抵抗的發(fā)生,因此,骨骼肌脂質(zhì)沉積是誘導(dǎo)骨骼肌IR發(fā)生的主要原因之一。線粒體氧化產(chǎn)物的增加促進IR的發(fā)展,導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)障礙。此外,骨骼肌纖維通過分泌多種骨骼肌因子,如脂聯(lián)素(adiponectin)、白介素-6(IL-6)、瘦素(leptin)、腫瘤壞死因子(TNF)、抵抗素(resistin)、內(nèi)脂素(visfatin)等,通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌的途徑參與體內(nèi)各種代謝過程,在胰島素抵抗發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用,這些研究表明,骨骼肌因子和甲狀腺激素具有一些共同的生理效應(yīng),包括調(diào)節(jié)能量消耗和糖、脂代謝。目前甲狀腺軸和骨骼肌組織的相互作用機制尚不清楚,考慮骨骼肌胰島素抵抗及氧化應(yīng)激等病理生理環(huán)節(jié)均可能參與其中。目的通過臨床試驗及動物試驗,探討甲狀腺功能減退癥對母胎骨骼肌胰島素抵抗的影響及其可能機制,了解骨骼肌胰島素抵抗及氧化應(yīng)激等病理生理環(huán)節(jié)是否參與甲狀腺激素調(diào)節(jié)母胎糖代謝功能。方法一、臨床研究:1.采用病例對照研究,于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及省婦幼保健院婦科門診收集臨床甲減流產(chǎn)組(Hypo組)和自行要求終止妊娠的正常對照組(Con組)。Hypo組入組標準為TSH10m IU/L。通過自制《基本信息記錄表》獲得受試者基本人口學(xué)信息、孕產(chǎn)史、孕期生活情況及相關(guān)疾病等情況。2.空腹靜脈血采樣后及時分離血清,測定甲狀腺功能、甲狀腺自身抗體、空腹血糖和空腹血胰島素,根據(jù)公式計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。3.取絨毛組織,勻漿離心后測定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。二、動物實驗:1.雌鼠甲減模型建立:140只雌性Sprague-Dawley大鼠隨機分為兩組。正常對照組((Normal group,n=50)飲用普通水,丙基硫氧嘧啶(PTU)飲水組(PTU group,n=90)飲用0.05%PTU水溶液,6周后隨機在兩組中各選取6只大鼠取血,測定大鼠甲狀腺功能,了解是否成功建立成年期雌性甲狀腺功能減退癥大鼠模型。2.甲減妊娠孕鼠模型:成年雌性大鼠甲減模型造模成功后,分別將正常對照組和PTU飲水組兩組大鼠通過雌雄2:1合籠,受孕后分別建立正常妊娠組(NPG,n=21)、甲減妊娠組(HPG,n=39)孕鼠模型。隨機分配兩組大鼠分別于孕8.5天(E8.5)、孕13天(E13)、孕21天(E21)取兩組妊娠大鼠行剖腹產(chǎn),于孕21天觀察胚胎吸收數(shù),計算流產(chǎn)率,分別留取兩組孕21天(E21)母鼠以及各亞組(E8.5、E13、E21)胎鼠的血樣和骨骼肌。3.母鼠部分:用便攜式血糖儀檢測兩組E21母鼠空腹血糖(FBG),用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測母鼠三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、促甲狀腺激素(TSH)、胰島素(FINS)、氧化應(yīng)激指標超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、脂聯(lián)素(Adiponectin)和瘦素(Leptin)以及抵抗素(Resistin)水平。Western blotting分析兩組孕21天(E21)母鼠骨骼肌胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)、胰島素受體底物-1(IRS-1)以及胰島素受體(IRC)蛋白水平。采用PAS和油紅O免疫組織化學(xué)染色方法,觀察兩組母鼠骨骼肌糖原和脂肪的沉積。4.胎鼠部分:用ELISA法檢測E8.5、E13、E21天胎鼠T3、T4、TSH、FBG、FINS、氧化應(yīng)激指標丙二醛(MDA)、SOD和GSH-Px、脂聯(lián)素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、內(nèi)脂素(visfatin)、鳶尾素(Irisin)、腫瘤壞死因子(TNF-α)以及抵抗素(Resistin)水平。Western blotting檢測E8.5、E13、E21天胎鼠骨骼肌線粒體基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)、肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)的表達以及骨骼肌胰島素信號通路相關(guān)蛋白GLUT4、IRC、IRS-1及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的蛋白表達。采用PAS和油紅O染色,觀察兩組胎鼠分別在E8.5、E13、E21天骨骼肌糖原和脂肪的沉積。結(jié)果臨床部分:1.比較妊娠甲減流產(chǎn)組(Hypo組)和正常妊娠對照組(Con組)兩組人群一般情況,我們發(fā)現(xiàn)兩組受試者年齡及妊娠周齡具有顯著差異(P0.05),而兩組受試者的教育程度、生活方式(吸煙、飲酒史)、BMI、血壓、孕產(chǎn)史均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2.Hypo組及Con組TSH有顯著性差異(P0.05)。比較兩組間FT3、FBG水平,無統(tǒng)計學(xué)差異。Hypo組的FT4水平顯著低于Con組,Hypo組的FINS、HOMA-IR水平以及TPOAb陽性比例顯著高于Con組(P0.05)。3.比較兩組間絨毛組織SOD、MDA水平,Hypo組絨毛組織SOD水平較Con組降低,MDA水平較Con組升高,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。動物實驗部分:1.母鼠部分:1.1本實驗成功建立甲狀腺功能減退癥雌鼠模型,在妊娠模型中,我們觀察到與正常對照組相比,PTU飲水組的受孕率未見明顯差異。甲減妊娠組和正常妊娠組相比,流產(chǎn)率增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。1.2比較甲減妊娠組和正常妊娠組兩組孕21天母鼠胰島素(FINS)水平,甲減妊娠組顯著高于正常妊娠組(P0.05),兩組間空腹血糖(FBG)無顯著差異。1.3甲減妊娠組孕21天母鼠骨骼肌勻漿中SOD和GSH-Px水平明顯低于正常妊娠組(P0.05)。1.4與正常妊娠大鼠比較,甲減妊娠母鼠的骨骼肌勻漿中脂聯(lián)素、瘦素以及抵抗素水平均明顯升高(P0.05)。1.5甲減妊娠母鼠骨骼肌GLUT4、IRS-1和IRC蛋白的表達水平均低于正常妊娠組(P0.05)。1.6甲減妊娠母鼠骨骼肌PAS和油紅O染色陽性率均明顯高于正常妊娠組(P0.05)。2.胎鼠部分2.1測定不同胎齡胎鼠的甲狀腺功能指標,結(jié)果顯示甲狀腺激素水平(T3、T4)和促甲狀腺激素(TSH)隨胎齡的增長而升高,提示胎鼠垂體-甲狀腺軸功能隨著胎齡增長在發(fā)育成熟。在21天胎齡亞組中,我們觀察到PTU組的T3水平顯著低于同胎齡的正常妊娠組,TSH水平顯著高于同胎齡的正常妊娠組(P0.05),而T4在甲減妊娠組和正常妊娠組之間差異不顯著。2.2隨著胎鼠胎齡的增加,甲減妊娠組和正常妊娠組胎鼠的FBG、FINS、HOMA-IR、TG和TC均呈升高趨勢(P0.05)。與同胎齡的正常妊娠組相比,甲減妊娠組的FBG、FINS、HOMA-IR、TG和TC均隨胎齡的增加而升高,僅甲減妊娠組21天胎齡亞組胎鼠的TC較同胎齡的正常妊娠組胎鼠顯著升高(P0.05),其余指標兩組之間差異不顯著。2.3結(jié)果顯示在兩組胎鼠的21天胎齡亞組(E21組)中,骨骼肌組織中MDA水平均明顯高于同組8.5天胎齡組(P0.05),而E13組與E8.5組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。GSH-Px、SOD和CAT水平在E13和E21組明顯高于E8.5組(P0.05)。各胎齡甲減妊娠組與正常妊娠組相比,MDA、GSH-Px、SOD、CAT水平均無顯著性差異(P0.05)。2.4除正常組E13亞組的脂聯(lián)素(Adiponectin)和PTU組E13亞組的鳶尾素(irisin)外,甲減妊娠組和正常妊娠組的E13和E21亞組胎鼠的脂聯(lián)素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、內(nèi)脂素(Visfatin)、抵抗素(Resistin)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平分別顯著高于同組E8.5亞組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與正常妊娠組的E21亞組的TNF-α相比較,甲減妊娠組E21亞組TNF-α水平顯著升高(P0.05)。但在胚胎發(fā)育不同階段,同胎齡的甲減妊娠組與正常妊娠組兩組間脂聯(lián)素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、內(nèi)脂素(Visfatin)、抵抗素(Resistin)、鳶尾素(irisin)水平無明顯差異(P0.05)。2.5隨著胎鼠發(fā)育,參與骨骼肌線粒體氧化的蛋白質(zhì)水平逐漸升高,結(jié)果顯示,與E8.5相比,甲減妊娠組和正常妊娠組的E21亞組的線粒體相關(guān)蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體-γ輔助激活劑-1α(PGC-1α)和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)均顯著增加(P0.05)。但在胚胎發(fā)育不同階段,同胎齡的甲減妊娠組與正常妊娠組比較,PGC-1α和CPT1水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.6隨著胎鼠發(fā)育,骨骼肌胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)水平逐漸升高。結(jié)果顯示,與E8.5相比,甲減妊娠組和正常妊娠組的E21亞組的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)、胰島素受體底物-1(IRS-1)、胰島素受體(IRC)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白表達水平均升高,除了甲減妊娠組GLUT4無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),余指標均有顯著差異(P0.05)。在胚胎發(fā)育不同階段,同胎齡的甲減妊娠組與正常妊娠組比較差異無顯著性(P0.05)。2.7骨骼肌PAS染色顯示,在E8.5、E13和E21亞組,甲減妊娠組和正常妊娠組骨骼肌胞漿內(nèi)均有葡萄糖原存在,且PAS染色陽性率隨胎齡的增加而增加。骨骼肌冰凍切片油紅O染色顯示甲減妊娠組E13、E21組有脂質(zhì)異位沉積,與E8.5組比較有顯著性差異(P0.05)。但同胎齡時,甲減妊娠組與正常妊娠組相比,肌糖原和脂肪沉積無顯著差異(P0.0 5)。結(jié)論1.動物實驗提示甲狀腺功能減退可以促進母鼠胰島素抵抗以及骨骼肌脂肪異位沉積。2.動物實驗提示,隨著胎鼠的生長,胎鼠的甲狀腺功能逐步完善。IRS-1、IRC、PI3K、GLUT4蛋白均可在胎鼠骨骼肌組織中表達。在胚胎發(fā)育的不同階段,胎鼠骨骼肌脂肪因子、PGC-1α、CPT1、GLUT4、IRC、IRS-1及PI3K蛋白質(zhì)水平逐步升高。3.母體甲狀腺功能減退可以影響母體及子代糖代謝,骨骼肌胰島素抵抗與骨骼肌組織氧化應(yīng)激失衡不是母體甲減對子代糖代謝影響的核心環(huán)節(jié)。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R714.256
【部分圖文】：
圖 1. 甲狀腺功能減退癥對成年孕鼠骨骼肌的影響。ELISA 法檢測 PTU 組和正常組骨骼肌勻漿中(A)GSH-Px、(B)SOD、(C)脂聯(lián)素、(D)leptin 和(E)Resistin 的含量。(F)孕鼠骨骼肌 GLUT4、IRC 和 IRS-1 蛋白的 westernblot 分析。圖 G 顯示兩組孕鼠骨骼肌 PAS 染色結(jié)果（×400），了解孕鼠骨骼肌糖原沉積；圖 H 顯示兩組大鼠骨骼肌冰凍切片中油紅 O 染色結(jié)果（×40），了解孕鼠骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)沉積。注：與正常飲水組組比較：*p<0.053.6 胎鼠臨床特點本實驗旨在探討孕鼠甲狀腺功能減退癥對胎鼠的影響。在不同孕期，從妊娠的 PTU 飲水組大鼠和正常大鼠中處死剖腹獲得胎鼠。表 7 顯示了不同胎齡胎鼠的甲狀腺功能指標，表明甲狀腺激素水平(T3、T4)和促甲狀腺激素(TSH)隨胎齡的增長而升高，胎鼠甲狀腺功能隨著胎齡增長在發(fā)育成熟。PTU 組 21 天胎齡亞組T3水平顯著低于同胎齡的正常組，TSH水平顯著高于同胎齡的正常組(P<0.05，見表 7)。T4 在 PTU 組和正常組之間差異不顯著(21 天胚胎，見表 7)。
圖 2.胎鼠骨骼肌勻漿中氧化應(yīng)激指標的測定。在胎齡分別為 E8.5、E13 和 E21 時，用 ELISA 法檢測 PTU 組和正常組的(A)MDA、(B)GSH-Px、(C)SOD 和(D)CAT。與正常組相同胎齡亞組相比，*p<0.05 有統(tǒng)計學(xué)差異；與同組 8.5 天胎齡指標相比，#p<0.05 有統(tǒng)計學(xué)差異。SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；MDA:丙二醛；CAT：過氧化氫酶。3.9 胎鼠骨骼肌因子除正常妊娠組 E13 亞組胎鼠的脂聯(lián)素和甲減妊娠組 E13 亞組胎鼠的鳶尾素（irisin）外，甲減妊娠組和正常妊娠組的 E13 以及 E21 的脂聯(lián)素（Adiponectin）、瘦素（Leptin）、內(nèi)脂素（Visfatin）、抵抗素(Resistin)、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平分別顯著高于同組 E8.5 亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖 3)。與正常妊娠組的 E21 亞組的 TNF-α 相比較，甲減妊娠組 E21 亞組 TNF-α 水平顯著升高(P<0.05)。PTU 組與正常組兩組間脂聯(lián)素（Adiponectin）、瘦素（Leptin）、內(nèi)脂素（Visfatin）、抵抗素(Resistin)、鳶尾素（irisin）水平無明顯差異(P>0.05)。
圖 3. ELISA 法檢測兩組胎鼠不同胎齡的骨骼肌勻漿中(A)脂聯(lián)素、(B)瘦素、(C)內(nèi)脂素、(D)抵抗素、(E)鳶尾素和(F)腫瘤壞死因子 α 的含量。與正常妊娠組相同胎齡亞組相比，*p<0.05 有統(tǒng)計學(xué)差異；與同組 8.5 天胎齡亞組指標相比，#p<0.05 有統(tǒng)計學(xué)差異。Visfatin：內(nèi)脂素；Adiponectin：脂聯(lián)素；Leptin：瘦素；Resistin：抵抗素；irisin：鳶尾素；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；3.10 胎鼠骨骼肌線粒體及胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 1（CPT）缺乏癥是線粒體脂肪酸氧化的常見疾病。為了進一步研究甲狀腺功能減退癥對線粒體和胰島素抵抗的影響，我們用Western-blot 分析了參與線粒體氧化和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)(見圖 4 中 A 圖)。結(jié)果顯示，與同組 E8.5 亞組相比，甲減妊娠組和正常妊娠組 E21 的線粒體相關(guān)
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本文編號：
2878369
