發(fā)布時(shí)間：2020-11-10 17:12

　　 胎盤是妊娠過程中形成的一個(gè)獨(dú)特且高度動(dòng)態(tài)變化的臨時(shí)器官,對孕產(chǎn)婦及胎兒的健康至關(guān)重要。DNA甲基化作為經(jīng)典的表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式,其在胎盤發(fā)育及滋養(yǎng)細(xì)胞合體化中的作用,以及這種調(diào)控異常是否參與子癇前期的發(fā)生,目前均不清楚。本研究綜合利用人原代滋養(yǎng)細(xì)胞(Human primary trophoblast,PHT)、細(xì)胞系及臨床樣本,采用免疫組織化學(xué)、Western Blot、免疫熒光、生物信息學(xué)分析等技術(shù),明確5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)1、3A、3B在人正常胎盤及子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)模式;闡明DNMT1、3A、3B在滋養(yǎng)細(xì)胞合體化過程中的作用;篩選合體化前后潛在受甲基化調(diào)控的差異表達(dá)基因;最后探明DNMTs與CREB信號(hào)通路的相互關(guān)系。獲得的研究結(jié)果如下:一、滋養(yǎng)細(xì)胞中DNMTs的表達(dá)模式和甲基化水平利用人早孕絨毛組織、人絨毛合體滋養(yǎng)層重建模型、原代滋養(yǎng)細(xì)胞體外自發(fā)合體化模型及BeWo細(xì)胞系體外誘導(dǎo)合體化模型,通過免疫組織化學(xué)、免疫熒光、Western Blot等技術(shù),研究DNMTs在滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)模式,結(jié)果顯示:DNMTs及5mC在早孕絨毛組織中均高表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞層,少量表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞層,在新發(fā)合體滋養(yǎng)細(xì)胞層亦表達(dá)較低;在原代滋養(yǎng)細(xì)胞體外自發(fā)合體化及BeWo細(xì)胞系誘導(dǎo)合體化過程中均伴隨DNMTs的降低表達(dá)。二、DNMTs在滋養(yǎng)細(xì)胞合體化過程中的作用采用細(xì)胞免疫熒光、Western Blot等技術(shù),探究DNMTs差異表達(dá)對BeWo細(xì)胞系合體化的影響,結(jié)果顯示:DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza抑制DNMTs的表達(dá),BeWo細(xì)胞合體化增強(qiáng);過表達(dá)DNMTs后BeWo細(xì)胞合體化受到阻礙。在原代滋養(yǎng)細(xì)胞體外自發(fā)合體化過程中利用cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路抑制劑H89處理及BeWo細(xì)胞系5-aza誘導(dǎo)去甲基化模型中探究DNMTs與CREB信號(hào)通路的相互關(guān)系。Western Blot結(jié)果顯示H89能夠顯著抑制原代滋養(yǎng)細(xì)胞體外自發(fā)合體化過程中CREB磷酸化及合體化標(biāo)志物蛋白水平的表達(dá),但因自發(fā)合體化引起的DNMTs的下調(diào)未能恢復(fù);5-aza可誘導(dǎo)BeWo細(xì)胞系中DNMTs蛋白表達(dá)降低、磷酸化CREB蛋白表達(dá)升高。三、篩選合體化前后潛在受甲基化調(diào)控的差異表達(dá)基因基于原代滋養(yǎng)細(xì)胞體外自發(fā)合體化前后的甲基化芯片測序數(shù)據(jù)及GEO網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫,運(yùn)用GO和KEGG聚類方法篩選出合體化前后去甲基化并且上調(diào)表達(dá)的差異基因,并利用熒光定量PCR、Western Blot、免疫組織化學(xué)等技術(shù)對差異基因驗(yàn)證。篩選出59個(gè)在合體化過程中去甲基化并且上調(diào)表達(dá)的目標(biāo)基因,并進(jìn)一步在BeWo細(xì)胞去甲基化模型中證實(shí)甲基化水平升高、轉(zhuǎn)錄組表達(dá)降低的調(diào)控模式,初步篩選出合體化過程中受甲基化調(diào)控的靶標(biāo)因子Wnt7a。四、PE胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中DNMTs的表達(dá)模式和甲基化水平利用對照個(gè)體及PE足月胎盤組織以及分離的原代滋養(yǎng)細(xì)胞體外自發(fā)合體化模型,采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光、Western Blot等技術(shù),研究DNMTs在PE滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果顯示:PE胎盤組織中合體滋養(yǎng)細(xì)胞減少,DNMTs及5mC表達(dá)水平均高于正常胎盤組織;PE胎盤原代滋養(yǎng)細(xì)胞體外自發(fā)合體化能力降低。綜合以上結(jié)果,我們認(rèn)為,在滋養(yǎng)細(xì)胞合體化過程中DNMTs下調(diào)表達(dá),甲基化水平降低;DNA甲基化可能通過調(diào)控CREB信號(hào)通路磷酸化激活參與調(diào)控合體化過程;Wnt7a是在合體化過程中受甲基化調(diào)控的靶標(biāo)因子;DNMTs異常表達(dá)影響PE胎盤中滋養(yǎng)細(xì)胞的合體化進(jìn)程,可能與PE發(fā)生相關(guān)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R714
【部分圖文】：

組之間的差異，且 P 值<0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少包括三組樣品重復(fù)。2 結(jié)果2.1 早孕絨毛組織中 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的表達(dá)模式和甲基化水平免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示（圖 1A），在 6-8 周的早孕胎盤絨毛組織中，CK7 標(biāo)記絨毛組織的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞（CTB），CTB 的外側(cè)為合體滋養(yǎng)細(xì)胞（STB），通過連續(xù)切片可以看出，DNMT1、3A、3B 和 5mC 在 CTB 層的表達(dá)都明顯高于 STB層，提示 CTB 中的甲基化水平高于 STB。合體滋養(yǎng)層重建結(jié)果顯示（圖 1B），新發(fā) STB 層 DNMT1、3A、3B 和 5mC 的表達(dá)在 STB 層均顯著低于 CTB 層，提示 CTB 向 STB 分化過程中 DNMTs 下調(diào)表達(dá)，甲基化水平可能降低。

細(xì)胞核聚集、合胞體增多，融合效率達(dá) 67%（圖 2B），且 DNMT1、3A、3B 和 5mC 均下調(diào)表達(dá)（圖2C）。Westernblot 印跡分析結(jié)果顯示，48h 后合體化標(biāo)志物 Syncytin-1、GCM1、β-HCG 蛋白水平升高，DNMTs 蛋白表達(dá)降低，表明在 48h 體外自發(fā)合體化后伴隨 DNMTs 表達(dá)降低（圖 2D）。接著在 BeWo 細(xì)胞系中建立合體化模型，利用cAMP 信號(hào)通路激活劑 FSK 以及 8-Br-cAMP 誘導(dǎo)細(xì)胞合體化[5,18]，72h 后，免疫熒光標(biāo)記 E-cadherin，在誘導(dǎo)組均表達(dá)降低且出現(xiàn)細(xì)胞核聚集成簇現(xiàn)象（圖 2E）

圖 3 DNMTs 差異表達(dá)對 BeWo 細(xì)胞合體化的影響Figure 3 The Effect of differential expressed DNMTs on the fusion of BeWo cellsA. Immunofluorescence detecting cell fusion after 5-aza treatment; B. Immunofluorescencedetection of co-localization of E-cad with 5mC, DNMT1, 3Aand 3B following 5-azatreatment in BeWo cells; C. Western blot analysis of DNMTs and syncytiotrophoblastmakers proteins expression under 5-aza treatment in BeWo cells; D. Western blot analysis ofDNMTs and syncytiotrophoblast makers expression after overexpression of DNMT1, 3A, 3Bcombined with fusion induction in BeWo cells; E. Immunofluorescence detection of cellfusion under forced expression of DNMT1, 3A, 3B combined with Forskolin treatment. Scalebar 50μm; F. qRT-PCR detection mRNAlevel of DNMTs and syncytiotrophoblast makers inForskolin treatment BeWo cells with forced expression of DNMT1, 3A, 3B.2.4 DNMTs 參與調(diào)控 CREB 信號(hào)通路
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李利玲;喬福元;;滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤調(diào)控因子與妊娠期高血壓疾病[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2007年10期

2 侯蕾;陳必良;張易;柏露;;流式細(xì)胞儀分離人早孕絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞及鑒定[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2006年11期

3 Carlini L.;Villa A.;Busci L. ;朱國棟;;選擇性子宮動(dòng)脈栓塞:低風(fēng)險(xiǎn)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的新療法[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(婦產(chǎn)科學(xué)分冊);2006年11期

4 王鴻艷;滋養(yǎng)細(xì)胞與妊娠高血壓綜合征發(fā)病的關(guān)系[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2003年03期

5 黎華文 ,李英勇 ,王芳;葡萄胎表皮生長因子受體表達(dá)與滋養(yǎng)細(xì)胞增生和葡萄胎惡變的相關(guān)性研究[J];中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志;2002年08期

6 D. G. Mutch;于黎明;;胸部CT對非轉(zhuǎn)移性妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤分期的應(yīng)用[J];寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1988年04期

7 楊潤芳;滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤化療病人的口腔護(hù)理[J];山西護(hù)理雜志;1989年04期

8 王美清,袁而恩,李素英,于惠霞,逄黎毅;妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤免疫組織化學(xué)研究[J];山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1989年03期

9 武萃靄;;葡萄胎刮宮前后血人絨毛膜促性腺激素變化的臨床意義(附96例分析)[J];武漢醫(yī)學(xué)雜志;1989年Z1期

10 祝國光;;滋養(yǎng)細(xì)胞疾患高危因素的認(rèn)識(shí)及其臨床意義[J];中國腫瘤臨床;1989年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 丁海林;滋養(yǎng)細(xì)胞高表達(dá)CD81導(dǎo)致母體Treg/Th17免疫失衡參與子癇前期發(fā)病機(jī)制研究[D];南京大學(xué);2019年

2 譚彬;滋養(yǎng)細(xì)胞p38-Wip1反饋通路異常誘導(dǎo)子癇前期發(fā)生機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2019年

3 張司明;淋巴細(xì)胞趨化因子及其受體在母—胎界面的作用及機(jī)制[D];上海交通大學(xué);2016年

4 李志芳;STOX1通過PI3K/AKT信號(hào)通路對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控及在早期不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中作用機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

5 王雅琴;USP22基因在人早孕期母—胎界面的表達(dá)及對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性的影響[D];武漢大學(xué);2014年

6 鄧欽尹;GnT-V調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能在子癇前期發(fā)病中作用機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

7 吳維光;缺氧誘導(dǎo)因子1在正常妊娠中的作用及與妊高征的關(guān)系[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

8 張磊;滋養(yǎng)細(xì)胞系（HPT-8）的建立和鑒定以及HBV在滋養(yǎng)細(xì)胞中分布的膠體金探針示蹤研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

9 胡蓉;用蛋白質(zhì)組學(xué)和RNA干擾技術(shù)研究滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧與子癇前期發(fā)病的關(guān)系[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

10 馬毅;中藥小檗堿、薯蕷皂甙對滋養(yǎng)細(xì)胞糖代謝及胎盤激素分泌的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 顧珺巍;DNA甲基化在人滋養(yǎng)細(xì)胞合體化中的調(diào)控作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2019年

2 彭海燕;miR-137對GDM血管內(nèi)皮細(xì)胞與滋養(yǎng)細(xì)胞作用的研究[D];上海交通大學(xué);2018年

3 楊苗苗;GnRHa在低危滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤化療過程中作用的研究[D];鄭州大學(xué);2019年

4 宋瓊芳;高遷移率族蛋白B1-Toll樣受體4對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和增殖的影響及其作用機(jī)制[D];福建醫(yī)科大學(xué);2018年

5 侯佩琴;黃芩苷對JEG-3滋養(yǎng)細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用[D];山西醫(yī)科大學(xué);2018年

6 李鵬云;缺氧條件下HIF-1α通過調(diào)控CXCR4影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移能力的研究[D];鄭州大學(xué);2018年

7 芮塬;TRAIL對滋養(yǎng)細(xì)胞的功能及侵襲調(diào)控機(jī)制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

8 陳國慶;LncRNA DANCR在重度子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)及其對滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

9 孫曼;YAP在子癇前期胎盤組織中的表達(dá)及對滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為影響機(jī)制研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

10 林容;TNFAIP8在早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞上的表達(dá)及其沉默后對早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2878156