【摘要】：水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian disease virus,ADV)引起的一種持續(xù)性病毒性傳染病。ADV感染幼貂后可引發(fā)嚴(yán)重的急性間質(zhì)性肺炎,死亡率極高;而成年水貂感染ADV后則會形成持久性感染,癥狀表現(xiàn)為腎小球腎炎,漿細(xì)胞增多,高丙種球蛋白血癥,動脈炎,生殖性能減退和自發(fā)性流產(chǎn),給全球的水貂養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病致病機(jī)理特殊,至今未研制出有效的疫苗制劑,只能通過多種診斷方法篩選和淘汰病貂,達(dá)到根除疾病的目的。雖然該病的診斷方法較多,但大多數(shù)都不適合基層單位使用,即使是應(yīng)用最廣的對流免疫電泳(CIEP)法,也因其耗時長和易散毒的缺點(diǎn),限制了其在基層的推廣應(yīng)用。目前迫切需要建立一種更為安全簡便,且能廣泛應(yīng)用于基層單位的診斷方法。Dot-ELISA方法除了具有常規(guī)ELISA的優(yōu)點(diǎn)外,還具有用量少,操作簡便,不需要任何儀器、成本低廉,結(jié)果易判斷且能長期保存等優(yōu)點(diǎn),非常適用于現(xiàn)場檢測。本試驗應(yīng)用PCR技術(shù)從ADV-G中擴(kuò)增出VP2全長基因和VP2截短基因;通過重疊延伸剪接技術(shù)將VP2截短基因與本實驗室已驗證的,具有良好反應(yīng)原性的兩段NS1截短基因(NS1-2和NS1-3)進(jìn)行融合,獲得兩段融合基因SPb和SPc;將VP2全長基因、VP2截短基因以及兩段融合基因SPb和SPc分別與克隆載體pMD18-T連接,構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒并對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定;將鑒定后的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,并與原核表達(dá)載體pGEX-4T-1連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定和測序;將鑒定后的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21,探索目的蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件,并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析;SDS-PAGE結(jié)果顯示4段表達(dá)蛋白均與預(yù)期大小相符,Western blot結(jié)果顯示每段蛋白均能被貂抗ADV陽性血請識別,具有良好反應(yīng)原性;分別對表達(dá)的4段蛋白和NS1全基因蛋白、NS1-2蛋白、NS1-3蛋白(實驗室之前構(gòu)建的NS1截短表達(dá)蛋白)進(jìn)行純化,再以7種純化蛋白作為包被抗原分別建立Dot-ELISA方法;將所建立的Dot-ELISA方法與CIEP進(jìn)行對比。通過對比分析可知,各抗原的Dot-ELISA方法敏感性均高于CIEP,而與其它抗原相比,融合抗原SPc作為包被抗原所建立的Dot-ELISA方法敏感性高,特異性強(qiáng)。
【圖文】：

ADVVP2截短基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

結(jié)果P2 截短基因，經(jīng) 1%瓊見圖 1-2。1-1 ADV VP2 基因 PCR 擴(kuò)regram of the VP2 gene amp子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：VP2基因ker；1：PCR product of VP
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.92

【參考文獻(xiàn)】

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3 劉潤珍,李世雄,王虹;應(yīng)用酶標(biāo)斑點(diǎn)紙條法診斷水貂阿留申病的研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);1990年05期

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本文編號：2520586