發(fā)布時間：2019-07-20 09:27

【摘要】：本研究從遼寧發(fā)病雞群采集的病料經SPF雞胚接種傳代分離病毒,并其進行了PCR和測序分析鑒定。結果,從病料中經SPF雞胚接種傳代分離出一株禽腺病毒,經PCR和測序分析鑒定確定該分離株為禽腺病毒C種、血清4型,命名為LN160130;通過對52 k和hexon基因同源性比對,LN160130與我國近年報道的禽腺病毒血清4型同源性最高,52 k和hexon基因的同源性均為100%;與國外流行的血清4型毒株相比,LN160130的52k基因同源性99.3%~100%,hexon基因同源性98.7%~99.8%。遺傳演化分析結果表明,LN160130分離株與我國禽腺病毒血清4型流行毒株在同一分支內,而與國外禽腺病毒血清4型毒株不在同一分支,存在遺傳差異,說明中國流行的血清4型禽腺病毒有自身地域特點。
【圖文】：

第6期王娟等：禽腺病毒血清4型的分離鑒定及遺傳演化分析圖1禽腺病毒的PCR檢測Fig.1PCRdetectionoffowladenovirus1：用引物對52k-fw＋52k-rv進行PCR擴增；2：用引物對HF2＋HR2進行PCR擴增；M：DNA分子質量標準；a：組織樣品；b：雞胚尿囊液1：PCRamplificationbyprimers52k-fw＋52k-rv；2：PCRamplificationbyprimersHF2+HR2;M：DL2000DNAMarker;a：Tissuesamples;b：Chickenembryoallantoicfluid組織研磨儀充分研磨后加入適量無菌PBS，反復凍融3次，10000r/min離心10min。取上清液經0.22m濾器過濾，將過濾后的無菌病毒液接種6.5日齡SPF雞胚卵黃囊中，，接種劑量為每胚0.2mL，于37℃孵化箱孵育。棄去24h內死亡的雞胚。37℃培養(yǎng)4d后無菌條件下收獲雞胚尿囊液，置－70℃儲存?zhèn)溆�。此雞胚尿囊液為病毒分離物的F1代，按上述方法將病毒在SPF雞胚連續(xù)傳代3代后進行PCR鑒定。PCR鑒定為陽性的病毒分離物經有限稀釋法在SPF雞胚連續(xù)傳代3代進行純化。1.6病毒分離物的PCR檢測及序列測定取含有病毒分離物的雞胚尿囊液200L，用于病毒基因組DNA的提取，同前述方法進行PCR鑒定。PCR產物經膠回收試劑盒回收純化，回收產物克隆至pMDI8－T載體，對PCR鑒定為陽性的克隆送北京六合華大基因科技有限公司測序。1.7血凝試驗按常規(guī)方法制備1％雞紅細胞，取含有病毒分離物的雞胚尿囊液按常規(guī)方法進行血凝試驗［16］，以檢測病毒分離物是否含有具有血凝活性的病原微生物。1.8序列比對及遺傳演化分析PCR擴增得到的52k和hexon基因序列經BLAST在線比對和Lasergene軟件分析（DNAStar），與國內外FAdV毒株的52k和hexon同源基因序列進行同源性比對，利用分子生物學軟件MEGA（6.0版本）對分離毒株和參考毒株進行遺傳演化分析，用最大似然法（MaximumLi

第6期王娟等：禽腺病毒血清4型的分離鑒定及遺傳演化分析圖1禽腺病毒的PCR檢測Fig.1PCRdetectionoffowladenovirus1：用引物對52k-fw＋52k-rv進行PCR擴增；2：用引物對HF2＋HR2進行PCR擴增；M：DNA分子質量標準；a：組織樣品；b：雞胚尿囊液1：PCRamplificationbyprimers52k-fw＋52k-rv；2：PCRamplificationbyprimersHF2+HR2;M：DL2000DNAMarker;a：Tissuesamples;b：Chickenembryoallantoicfluid組織研磨儀充分研磨后加入適量無菌PBS，反復凍融3次，10000r/min離心10min。取上清液經0.22m濾器過濾，將過濾后的無菌病毒液接種6.5日齡SPF雞胚卵黃囊中，接種劑量為每胚0.2mL，于37℃孵化箱孵育。棄去24h內死亡的雞胚。37℃培養(yǎng)4d后無菌條件下收獲雞胚尿囊液，置－70℃儲存?zhèn)溆�。此雞胚尿囊液為病毒分離物的F1代，按上述方法將病毒在SPF雞胚連續(xù)傳代3代后進行PCR鑒定。PCR鑒定為陽性的病毒分離物經有限稀釋法在SPF雞胚連續(xù)傳代3代進行純化。1.6病毒分離物的PCR檢測及序列測定取含有病毒分離物的雞胚尿囊液200L，用于病毒基因組DNA的提取，同前述方法進行PCR鑒定。PCR產物經膠回收試劑盒回收純化，回收產物克隆至pMDI8－T載體，對PCR鑒定為陽性的克隆送北京六合華大基因科技有限公司測序。1.7血凝試驗按常規(guī)方法制備1％雞紅細胞，取含有病毒分離物的雞胚尿囊液按常規(guī)方法進行血凝試驗［16］，以檢測病毒分離物是否含有具有血凝活性的病原微生物。1.8序列比對及遺傳演化分析PCR擴增得到的52k和hexon基因序列經BLAST在線比對和Lasergene軟件分析（DNAStar），與國內外FAdV毒株的52k和hexon同源基因序列進行同源性比對，利用分子生物學軟件MEGA（6.0版本）對分離毒株和參考毒株進行遺傳演化分析，用最大似然法（MaximumLi
【作者單位】： 東北農業(yè)大學生命科學學院;東北農業(yè)大學動物科學技術學院;中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室;
【基金】：蛋雞體系項目(CARS-41-K12) 國家科技支撐計劃項目(2015BAD12B03) 重點實驗室基本科研項目(SKLVBP2015008)
【分類號】：S852.65

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本文編號：2516634