發(fā)布時間：2019-07-20 09:27

【摘要】：本研究從遼寧發(fā)病雞群采集的病料經(jīng)SPF雞胚接種傳代分離病毒,并其進行了PCR和測序分析鑒定。結(jié)果,從病料中經(jīng)SPF雞胚接種傳代分離出一株禽腺病毒,經(jīng)PCR和測序分析鑒定確定該分離株為禽腺病毒C種、血清4型,命名為LN160130;通過對52 k和hexon基因同源性比對,LN160130與我國近年報道的禽腺病毒血清4型同源性最高,52 k和hexon基因的同源性均為100%;與國外流行的血清4型毒株相比,LN160130的52k基因同源性99.3%~100%,hexon基因同源性98.7%~99.8%。遺傳演化分析結(jié)果表明,LN160130分離株與我國禽腺病毒血清4型流行毒株在同一分支內(nèi),而與國外禽腺病毒血清4型毒株不在同一分支,存在遺傳差異,說明中國流行的血清4型禽腺病毒有自身地域特點。
【圖文】：

第6期王娟等：禽腺病毒血清4型的分離鑒定及遺傳演化分析圖1禽腺病毒的PCR檢測Fig.1PCRdetectionoffowladenovirus1：用引物對52k-fw＋52k-rv進行PCR擴增；2：用引物對HF2＋HR2進行PCR擴增；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；a：組織樣品；b：雞胚尿囊液1：PCRamplificationbyprimers52k-fw＋52k-rv；2：PCRamplificationbyprimersHF2+HR2;M：DL2000DNAMarker;a：Tissuesamples;b：Chickenembryoallantoicfluid組織研磨儀充分研磨后加入適量無菌PBS，反復(fù)凍融3次，10000r/min離心10min。取上清液經(jīng)0.22m濾器過濾，將過濾后的無菌病毒液接種6.5日齡SPF雞胚卵黃囊中，，接種劑量為每胚0.2mL，于37℃孵化箱孵育。棄去24h內(nèi)死亡的雞胚。37℃培養(yǎng)4d后無菌條件下收獲雞胚尿囊液，置－70℃儲存?zhèn)溆�。此雞胚尿囊液為病毒分離物的F1代，按上述方法將病毒在SPF雞胚連續(xù)傳代3代后進行PCR鑒定。PCR鑒定為陽性的病毒分離物經(jīng)有限稀釋法在SPF雞胚連續(xù)傳代3代進行純化。1.6病毒分離物的PCR檢測及序列測定取含有病毒分離物的雞胚尿囊液200L，用于病毒基因組DNA的提取，同前述方法進行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化，回收產(chǎn)物克隆至pMDI8－T載體，對PCR鑒定為陽性的克隆送北京六合華大基因科技有限公司測序。1.7血凝試驗按常規(guī)方法制備1％雞紅細胞，取含有病毒分離物的雞胚尿囊液按常規(guī)方法進行血凝試驗［16］，以檢測病毒分離物是否含有具有血凝活性的病原微生物。1.8序列比對及遺傳演化分析PCR擴增得到的52k和hexon基因序列經(jīng)BLAST在線比對和Lasergene軟件分析（DNAStar），與國內(nèi)外FAdV毒株的52k和hexon同源基因序列進行同源性比對，利用分子生物學(xué)軟件MEGA（6.0版本）對分離毒株和參考毒株進行遺傳演化分析，用最大似然法（MaximumLi

第6期王娟等：禽腺病毒血清4型的分離鑒定及遺傳演化分析圖1禽腺病毒的PCR檢測Fig.1PCRdetectionoffowladenovirus1：用引物對52k-fw＋52k-rv進行PCR擴增；2：用引物對HF2＋HR2進行PCR擴增；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；a：組織樣品；b：雞胚尿囊液1：PCRamplificationbyprimers52k-fw＋52k-rv；2：PCRamplificationbyprimersHF2+HR2;M：DL2000DNAMarker;a：Tissuesamples;b：Chickenembryoallantoicfluid組織研磨儀充分研磨后加入適量無菌PBS，反復(fù)凍融3次，10000r/min離心10min。取上清液經(jīng)0.22m濾器過濾，將過濾后的無菌病毒液接種6.5日齡SPF雞胚卵黃囊中，接種劑量為每胚0.2mL，于37℃孵化箱孵育。棄去24h內(nèi)死亡的雞胚。37℃培養(yǎng)4d后無菌條件下收獲雞胚尿囊液，置－70℃儲存?zhèn)溆�。此雞胚尿囊液為病毒分離物的F1代，按上述方法將病毒在SPF雞胚連續(xù)傳代3代后進行PCR鑒定。PCR鑒定為陽性的病毒分離物經(jīng)有限稀釋法在SPF雞胚連續(xù)傳代3代進行純化。1.6病毒分離物的PCR檢測及序列測定取含有病毒分離物的雞胚尿囊液200L，用于病毒基因組DNA的提取，同前述方法進行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化，回收產(chǎn)物克隆至pMDI8－T載體，對PCR鑒定為陽性的克隆送北京六合華大基因科技有限公司測序。1.7血凝試驗按常規(guī)方法制備1％雞紅細胞，取含有病毒分離物的雞胚尿囊液按常規(guī)方法進行血凝試驗［16］，以檢測病毒分離物是否含有具有血凝活性的病原微生物。1.8序列比對及遺傳演化分析PCR擴增得到的52k和hexon基因序列經(jīng)BLAST在線比對和Lasergene軟件分析（DNAStar），與國內(nèi)外FAdV毒株的52k和hexon同源基因序列進行同源性比對，利用分子生物學(xué)軟件MEGA（6.0版本）對分離毒株和參考毒株進行遺傳演化分析，用最大似然法（MaximumLi
【作者單位】： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室;
【基金】：蛋雞體系項目(CARS-41-K12) 國家科技支撐計劃項目(2015BAD12B03) 重點實驗室基本科研項目(SKLVBP2015008)
【分類號】：S852.65

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙莉;周潔;高誠;;禽腺病毒載體研究進展[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2012年11期

2 周斌,鄭其升,劉華雷,曹瑞兵,陳溥言;禽腺病毒江蘇分離株的細胞培養(yǎng)特性[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2005年02期

3 劉岳龍,秦愛建,金文杰,崔治中,葉建強,王彬,何秀苗;鵝源腺病毒基因組E3區(qū)的鑒定和分析[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2005年06期

4 智海東;解生亮;楊志;王云峰;張宇輝;王牟平;孫建宏;陳洪巖;;禽腺病毒Ⅰ型瓊脂擴散抗原的研制及應(yīng)用[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2009年08期

5 羅思思;謝芝勛;劉加波;謝麗基;龐耀珊;鄧顯文;謝志勤;范晴;彭宜;;Ⅰ群禽腺病毒33K基因的原核表達與鑒定[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2012年01期

6 李梅，李永明，吳彤，周碧君;禽腺病毒細胞病變觀察和半數(shù)組織感染量測定[J];貴州農(nóng)學(xué)院學(xué)報;1997年01期

7 劉雪美;秦建如;趙海燕;李育豪;曹偉勝;;Ⅱ群禽腺病毒pⅢa基因的原核表達及抗原性分析[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2013年23期

8 孫錦;李秋艷;李云龍;黃兵;宋敏訓(xùn);李新華;;禽腺病毒QU株一個復(fù)制非必需區(qū)的鑒定[J];生物工程學(xué)報;2008年07期

9 羅思思;謝芝勛;劉加波;謝麗基;龐耀珊;鄧顯文;謝志勤;范晴;彭宜;;Ⅰ群禽腺病毒100K蛋白主要抗原區(qū)基因片段的表達及鑒定[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報;2012年05期

10 謝芝勛,MazharI.Khan;應(yīng)用PCR檢測禽腺病毒[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2000年04期

相關(guān)會議論文 前1條

1 李海英;尹燕博;郭妍妍;王曉紅;王守春;;Ⅰ群禽腺病毒12個血清型毒株Hexon蛋白全基因序列測定與分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張明明;Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定和生物學(xué)特性研究及重組禽腺病毒的構(gòu)建[D];揚州大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前7條

1 陳雪姣;Ⅰ群禽腺病毒湖北株的分離鑒定及致病性研究[D];長江大學(xué);2016年

2 邱麗葉;禽腺病毒熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

3 陳天驁;血清4型禽腺病毒GX2013毒株的生物學(xué)特性鑒定和檢測方法的建立[D];揚州大學(xué);2016年

4 王小輝;Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究[D];揚州大學(xué);2008年

5 武敏;Ⅰ群禽腺病毒JS株Ⅲa蛋白的原核表達及其單克隆抗體的研制[D];揚州大學(xué);2009年

6 張科;重組禽腺病毒JS-eGFP的生物學(xué)特性與致病性研究[D];揚州大學(xué);2005年

7 郝東敏;山東地區(qū)Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定及多價油乳劑滅活疫苗的研制[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

本文編號：2516634