發(fā)布時(shí)間：2019-07-13 15:57

【摘要】：流行性乙型腦炎,又稱日本乙型腦炎,是一種由蟲媒介導(dǎo)傳播的人獸共患病。給人類健康和生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大危害,接種疫苗是防治該病的主要手段。目前國(guó)內(nèi)豬乙型腦炎疫苗毒株都是基因Ⅲ型,隨著優(yōu)勢(shì)基因型從Ⅲ型逐步轉(zhuǎn)換成Ⅰ型,開發(fā)基因Ⅰ型疫苗顯得尤為迫切,本研究是通過制備基因Ⅰ型乙型腦炎病毒滅活苗,篩選出具有優(yōu)秀免疫原性的候選毒株。成功制備出了滅活苗,并通過小鼠免疫試驗(yàn)、豚鼠免疫試驗(yàn)、小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)和仔豬免疫試驗(yàn)初步篩選出兩株免疫原性較好的毒株。1.分離株的鑒定和毒株初步篩選1)分離株生物學(xué)特征研究:通過對(duì)病毒的復(fù)蘇,得到能夠穩(wěn)定傳代的四株(YA1、YA2、MY]、CZ1株)病毒,經(jīng)過RT-PCR鑒定為乙型腦炎病毒。在BHK-21細(xì)胞和鼠腦傳代制備出了不同的病毒液,通過測(cè)定四種毒株的TCID50和LD50發(fā)現(xiàn)鼠腦傳代后的病毒TCID50顯著升高,LD50顯著下降。病毒在BHK-21細(xì)胞傳達(dá)后滴度在104.6-105.8TCID50/0.2ml之間,鼠腦傳代后病毒滴度顯著上升,達(dá)到1011.8-1012.3TCID50/0.2ml,細(xì)胞傳代后半數(shù)致死量在10-3.5-10-4.2/0.025ml之間,鼠腦傳代后半數(shù)致死量顯著下降,LD50在10-7.3-10-6.3/0.025ml之間,因此選擇鼠腦病毒液作為制備滅活苗的病毒液。2)滅活苗的制備:將制備好的鼠腦病毒液通過甲醛滅活,通過滅活條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確立了 0.05%甲醛在37℃滅活48h的最佳滅活條件,通過劑型檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)制備出了質(zhì)量合格的四種毒株鼠腦滅活苗。3)毒株初步篩選:在制備出合格疫苗的基礎(chǔ)上,開展小鼠免疫試驗(yàn),通過腹腔接種后監(jiān)測(cè)小鼠血清JEV抗體水平,初步篩選免疫原性較好的毒株。結(jié)果顯示四種毒株制備的疫苗都具有良好的免疫原性,在二免后兩周YA1株和CZ1株組的小鼠抗體水平顯著高于商品化滅活苗組(P0.01),在二免后4周所有分離株組的小鼠抗體水平都顯著高于商品化滅活苗組(P0.01),但在絕對(duì)數(shù)值上YA1株和CZ1株組小鼠抗體水平更高,初步篩選出免疫原性較優(yōu)的YA1株和CZ1株。2.候選毒株免疫原性研究1)豚鼠免疫試驗(yàn):在初步篩選出YA1株和CZ1株后,開展了豚鼠免疫試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)了兩毒株作為豬乙型腦炎滅活苗候選毒株的可能性,豚鼠試驗(yàn)顯示CZ1株和YA1株都能使100%的豚鼠產(chǎn)生合格的血凝抑制抗體,相對(duì)于商品化滅活苗陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率更高、血凝抑制抗體效價(jià)也更高,二者之間CZ1株組豚鼠產(chǎn)生的血凝抑制抗體水平顯著高于YA1株組(P0.05)。2)小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn):疫苗在免疫3周齡小鼠后1周加強(qiáng)免疫一次,二免后1周使用1OLD50腦內(nèi)攻毒,結(jié)果顯示YA1株疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)率為70%,CZ1株疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)率為80%,而商品化的鼠腦滅活苗和減毒活疫苗的保護(hù)率分別為60%和70%。兩毒株都顯示出了優(yōu)良的保護(hù)力,CZ1株的保護(hù)力則更優(yōu)。3)仔豬免疫試驗(yàn):仔豬免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示兩個(gè)毒株都能使仔豬的抗體陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%,相對(duì)于商品化滅活苗抗體水平和中和抗體效價(jià)更高。同時(shí)抗體水平與前文的豚鼠免疫試驗(yàn)、小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果相符,二者之間CZ1株的免疫原性更好。
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圖片說明： 圖３．２邋４株病毒ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)逡逑ｉｇ．３．２邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｆｏｕｒ邋ｖｉｒｕｓ邋ｓｔｒａｉｎｓ逡逑ｌｌ；邋１邋？４邋分別為邋ＹＡ１、ＹＡ２、ＭＹ１、ＣＺ１邋株邋ＲＴ－ＰＣＲ邋檢測(cè)結(jié)果；逡逑５．空白對(duì)照組；７．陽(yáng)性對(duì)照組逡逑１－４．ＲＴ－ＰＣＲ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＹＡ１，ＹＡ２，ＭＹ１邋ａｎｄ邋ＣＺ１邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；邋５．邋Ｂｌａｎｋ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋；邋６．邋Ｔｈｅ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑
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圖片說明： Ｆｉｇ邋３．４邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｆｉｖｅ邋ｋｉｎｄｓ邋ｏｆ邋ｉｍｍｕｎｅ邋ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ逡逑４討論逡逑目前預(yù)防豬乙型腦炎病毒的疫苗主要是減毒活疫苗，該疫苗毒株為人用疫苗毒逡逑株，為基因ＩＩＩ型病毒，而國(guó)內(nèi)乙型腦炎優(yōu)勢(shì)基因型已經(jīng)從ＩＩＩ型轉(zhuǎn)變?yōu)椋毙停郏保玻�，同時(shí)逡逑又有研宄指出，免疫基因ＩＩＩ型疫苗只能對(duì)部分基因Ｉ型病毒產(chǎn)生保護(hù)力［６５］。在此背逡逑景下，研制出安全、有效的基因Ｉ型豬乙型腦炎滅活苗顯得尤為迫切。逡逑本研宄使用的四個(gè)毒株都是基因Ｉ型病毒，，ＹＡｌ、ＹＡ２、ＭＹ１為豬源毒株，ＣＺ１逡逑為蚊源毒株。在ＢＨＫ－２１細(xì)胞上都能穩(wěn)定傳代，但是病毒的滴度（ＴＣＩＤ５Ｇ）較低，逡逑同時(shí)對(duì)乳鼠的半數(shù)致死量（ＬＤ５0）也較高，因此ＢＨＫ－２１細(xì)胞病毒液不能作為疫苗逡逑生產(chǎn)用病毒液。將病毒經(jīng)過鼠腦傳代后，病毒滴度都有了較大的提升，乳鼠半數(shù)致逡逑死量大幅降低。由于乳鼠為其敏感試驗(yàn)動(dòng)物，乳鼠腦內(nèi)接種相對(duì)于ＢＨＫ－２１細(xì)胞接逡逑
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.4

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本文編號(hào)：2514106