發(fā)布時(shí)間：2019-07-12 09:14

【摘要】：本研究通過四個(gè)試驗(yàn),觀測(cè)了在不同溫度下鋅對(duì)原代培養(yǎng)肉雞雞胚肝細(xì)胞抗氧化性能及相關(guān)的分子指標(biāo)的影響,從細(xì)胞水平探討了鋅對(duì)肉雞抗熱應(yīng)激效應(yīng)及分子機(jī)制。試驗(yàn)一旨在通過建立可靠的肉雞雞胚熱敏肝細(xì)胞模型,并觀測(cè)肝細(xì)胞的持續(xù)活力,為后續(xù)研究鋅對(duì)原代培養(yǎng)肉雞雞胚肝細(xì)胞抗熱應(yīng)激效應(yīng)及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)用14胚齡雞胚分離得到雞胚肝細(xì)胞,并接種到六孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。臺(tái)盼藍(lán)染色顯示,細(xì)胞活率高達(dá)95%;糖原染色結(jié)果顯示,分離得到了純度理想的雞胚肝細(xì)胞;肝細(xì)胞可在培養(yǎng)到72h后匯合成單層,模型構(gòu)建成功后肝細(xì)胞的活力可穩(wěn)定維持3天,滿足開展后續(xù)試驗(yàn)的條件。試驗(yàn)二旨在確定原代培養(yǎng)肉雞雞胚肝細(xì)胞最佳的鋅添加水平及鋅作用的最佳時(shí)間,為后續(xù)研究鋅對(duì)原代培養(yǎng)肉雞熱敏雞胚肝細(xì)胞的抗熱應(yīng)激效應(yīng)及其分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)采用5×3兩因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),肝細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)5個(gè)添加鋅水平(0、50、100、200和400μM硫酸鋅形態(tài)的鋅)與3個(gè)鋅作用時(shí)間(12、24和48 h),共15個(gè)處理組,將同一處理的2個(gè)重復(fù)孔細(xì)胞收集到一個(gè)滅菌離心管中作為一個(gè)重復(fù)樣品,每組6個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明:在作用時(shí)間為12 h時(shí)、鋅水平為50μM時(shí)銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)活性顯著高于其它各處理組(P0.05);與對(duì)照組相比,加鋅水平為50、100、200和400μM均顯著上調(diào)了肝細(xì)胞金屬硫蛋白(MT)mRNA的表達(dá)(P0.0001),而四個(gè)添加水平之間并無顯著差異(P0.05)。根據(jù)以上結(jié)果,選擇鋅添加水平為50μM,作用時(shí)間為12h研究后續(xù)鋅對(duì)肝細(xì)胞的抗熱應(yīng)激分子機(jī)制。試驗(yàn)三旨在研究熱應(yīng)激狀態(tài)下肝細(xì)胞熱休克蛋白(HSP70、90)mRNA相對(duì)表達(dá)量及培養(yǎng)上清乳酸脫氫酶(LDH)活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化,以確定原代培養(yǎng)肉雞雞胚肝細(xì)胞受到熱應(yīng)激影響的最佳時(shí)間,為后續(xù)研究鋅對(duì)原代培養(yǎng)肉雞熱敏雞胚肝細(xì)胞的抗熱應(yīng)激效應(yīng)及其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)采用2×5兩因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)雞胚肝細(xì)胞培養(yǎng)溫度(40℃常溫和44℃高溫)與5個(gè)處理時(shí)間(1、2、4、6和8小時(shí)),共10個(gè)處理組。將同一處理的2個(gè)重復(fù)孔的細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞收集到一個(gè)滅菌離心管中作為一個(gè)重復(fù)樣品,每組6個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明:培養(yǎng)時(shí)間分別為4、6、8 h時(shí),與常溫組相比,高溫組顯著提高肝細(xì)胞培養(yǎng)液LDH酶活(P0.0001);在熱應(yīng)激(44℃)狀態(tài)下,培養(yǎng)4 h以內(nèi),隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加肝細(xì)胞HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P0.034);在熱應(yīng)激狀態(tài)下肝細(xì)胞HSP 90 mRNA相對(duì)表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而顯著升高(P0.023),在培養(yǎng)6 h達(dá)到最高,后又顯著降低(P0.0008)。根據(jù)以上結(jié)果,選擇熱應(yīng)激時(shí)間為4、6 h作為后續(xù)鋅對(duì)肝細(xì)胞的抗熱應(yīng)激分子機(jī)制。試驗(yàn)四采用2×3×2三因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。設(shè)2個(gè)雞胚肝細(xì)胞培養(yǎng)溫度(40℃和44℃)、3種鋅源處理(不添加鋅、50μM ZnSO4以及50μM中等鰲合強(qiáng)度Zn-Lys)與2個(gè)熱應(yīng)激處理時(shí)間(4 h與6 h),共12個(gè)處理組,每組6個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明,在常溫情況下,與未添加鋅組相比,添加ZnSO4提高了肝細(xì)胞CuZnSOD酶活(P=0.0048)。在高溫情況下,添加Zn-Lys組肝細(xì)胞CuZnSOD酶活顯著高于未添加鋅組及ZnSO4組(P=0.049);與常溫相比,高溫顯著升高了肝細(xì)胞MDA含量(P=0.006)。與未加鋅組相比,加鋅均能顯著提高肝細(xì)胞MT mRNA的表達(dá)量(P0.035);與常溫組相比,高溫顯著提高了肝細(xì)胞HSP70 mRNA的表達(dá)量(P0.0001)。在高溫情況下,與未加鋅組相比,添加ZnSO4組顯著降低了HSP70 mRNA表達(dá)量(P0.05);在常溫情況下,添加Zn-Lys組HSP90 mRNA的表達(dá)量顯著低于未加鋅和加ZnSO4組(P0.005)。在高溫情況下,處理4h時(shí),ZnSO4組HSP90 mRNA的表達(dá)量顯著低于未加鋅組和Zn-Lys組(P0.0003);與常溫組相比,高溫顯著提高了肝細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)(P0.0001)。在高溫處理6h時(shí),添加ZnSO4組及ZnLys組顯著下調(diào)了肝細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)(P0.0001)。綜上所述,加鋅可提高肉雞雞胚肝細(xì)胞抗氧化能力;熱應(yīng)激引起肉雞雞胚肝細(xì)胞氧化損傷;加鋅緩解了熱應(yīng)激引起肉雞雞胚肝細(xì)胞氧化損傷。
文內(nèi)圖片：
圖片說明：技術(shù)路線圖
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圖片說明： 培養(yǎng) 48 h 培養(yǎng) 72 h圖 2.1 肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞糖原染色鑒定細(xì)胞糖原染色鑒定結(jié)果見圖 2.2。肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的糖原，糖原染成紫紅色。微鏡觀察到陽性組視野中細(xì)胞 90%以上呈紫紅色，而陰性組并未，表明分離培養(yǎng)的肝細(xì)胞有較高的純度。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S831.5

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3 ;應(yīng)用中藥抗熱應(yīng)激效果好[J];四川畜禽;1995年02期

4 彭清字,程成;夏養(yǎng)蛋雞要添喂抗熱應(yīng)激藥物[J];農(nóng)村百事通;2000年14期

5 賈潔 ,楊雪峰 ,陳永耀;蛋雞抗熱應(yīng)激添加劑的研究進(jìn)展[J];中國(guó)家禽;2002年10期

6 肖一紅,寧章勇,劉思當(dāng);抗熱應(yīng)激藥物的臨床應(yīng)用[J];中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)刊;2002年14期

7 劉思當(dāng),肖一紅,寧章勇,商營(yíng)利,丁寶君;抗熱應(yīng)激藥物的效果比較實(shí)驗(yàn)[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2005年01期

8 張瑩;章世元;;抗熱應(yīng)激添加劑的種類和應(yīng)用[J];飼料博覽(技術(shù)版);2008年05期

9 ;雌畜禽慎用抗熱應(yīng)激添加劑[J];畜禽業(yè);2009年04期

10 易澤良;抗熱應(yīng)激藥物對(duì)產(chǎn)蛋雞效果的研究[J];中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志;1994年03期

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3 鄧琳;朱曉彤;高萍;束剛;趙婕;江青艷;王松波;王麗娜;;肉雞抗熱應(yīng)激添加劑的篩選和效果觀察[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十二次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2012年

4 孔天富;;夏季肉鴨的抗熱應(yīng)激措施[A];第五屆（2013）中國(guó)水禽發(fā)展大會(huì)會(huì)刊[C];2013年

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6 蔣守群;林映才;周桂蓮;鄭黎;劉炎和;余德謙;楊曉建;;抗熱應(yīng)激劑對(duì)黃羽肉雞生產(chǎn)性能和血清過氧化物狀態(tài)的影響[A];家禽研究最新進(jìn)展——第十一次全國(guó)家禽學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2003年

7 董虹;楊凱;穆祥;劉鳳華;許劍琴;;抗熱應(yīng)激中藥復(fù)方對(duì)大鼠空腸組織Hsp70表達(dá)的影響[A];第四屆中國(guó)畜牧科技論壇論文集[C];2009年

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5 河間市畜牧局 李淑鳳;肉鴨度夏這么管[N];河北科技報(bào);2006年

6 石家莊九通獸藥廠 白永強(qiáng);夏季蛋雞安全養(yǎng)殖4招[N];河北農(nóng)民報(bào);2012年

7 陳伯華;奶牛抗熱應(yīng)激的飼養(yǎng)措施[N];瓜果蔬菜報(bào).農(nóng)業(yè)信息周刊;2006年

8 季韞;防暑降溫早做準(zhǔn)備[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2006年

9 ;讓你的畜禽健康度夏[N];瓜果蔬菜報(bào).農(nóng)業(yè)信息周刊;2005年

10 山東省莒南縣畜牧局相邸鎮(zhèn)檢驗(yàn)檢疫所 時(shí)少磊　張永平;“火箭蛋”已沖高回落 降成本乃立業(yè)之根[N];河南科技報(bào);2012年

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2 曹文;急性熱應(yīng)激對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)的影響及電解質(zhì)的抗熱應(yīng)激效果[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

3 易宣;抗熱應(yīng)激藥物和氨基酸對(duì)嶺南黃雞生長(zhǎng)性能及血液生化指標(biāo)的影響[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

4 黃健暉;中草藥添加劑對(duì)奶�？篃釕�(yīng)激和提高產(chǎn)奶量的影響[D];福建農(nóng)林大學(xué);2009年

5 張道敬;不同抗熱應(yīng)激添加劑對(duì)肉雞生產(chǎn)性能和血液理化指標(biāo)的影響[D];廣西大學(xué);2002年

6 張琳琳;不同抗熱應(yīng)激添加劑對(duì)熱應(yīng)激小鼠精液品質(zhì)的影響[D];吉林大學(xué);2012年

7 付戴波;夏季高溫對(duì)錦江黃牛的影響及中藥抗熱應(yīng)激復(fù)方添加劑的篩選[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：2513613