發(fā)布時(shí)間：2019-07-11 09:00

【摘要】：J亞群禽白血病病毒(Avian leucosis virus subgroup J,ALV-J)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒,可以引起雞免疫抑制和多發(fā)性腫瘤。由于ALV-J變異速度快,機(jī)體較難獲得有效的免疫保護(hù),目前尚無(wú)防治該病的有效疫苗。天然免疫是機(jī)體抗感染的首要防線,病毒入侵后會(huì)被天然免疫系統(tǒng)識(shí)別,進(jìn)而引發(fā)相關(guān)免疫通路的活化和抗病毒反應(yīng)。天然免疫識(shí)別受體中Nod樣受體(Nod-like receptors,NLRs)、RIG-I樣受體(RIG-I-Iike receptors,RLRs)在抗RNA病毒中發(fā)揮著重要作用。本研究對(duì)ALV-J感染早期時(shí)黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族成員NLRP3炎癥轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討,為揭示ALV-J致病機(jī)制和宿主抗病毒免疫機(jī)制提供參考。首先,將本實(shí)驗(yàn)室分離的ALV-J臨床株(命名為AJV-HF211)進(jìn)行DF-1細(xì)胞增殖和鑒定,再將70只1日齡SPF雞隨機(jī)分為兩組,攻毒組42只,對(duì)照組28只,經(jīng)頸部皮下接種ALV-HF211細(xì)胞毒,0.2mL/只,2 x 104TCID50/mL,對(duì)照組接種細(xì)胞培養(yǎng)液,0.2mL/只。在感染不同天數(shù)后(days post infection,dpi)剖檢觀察病變,取肝臟制備石蠟切片。結(jié)果表明,攻毒組雞胸腺出血、萎縮,肝臟和脾臟有出血點(diǎn),膽囊萎縮、膽汁量少且呈淡黃色。此外,AJV-HF211毒株感染組織中炎性細(xì)胞增殖明顯。其次,通過RT-PCR方法檢測(cè)雞肝組織中病毒的核酸片段并設(shè)計(jì)擴(kuò)增MDA5、 NLRP3及其下游caspase-1及細(xì)胞因子IL-1β、1L-18、IFN-β和IFN-γ基因片段的特異性引物,進(jìn)一步建立SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量RT-PCR檢測(cè)方法(RT-qPCR),分別檢測(cè)感染組和對(duì)照組雞肝組織內(nèi)的MDA5、NLRP3及其下游接頭分子和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。RT-PCR檢測(cè)ALV-J結(jié)果表明,在感染9dpi,首次檢測(cè)到ALV-J特異性基因片段,且9-17dpi期間均能檢測(cè)到該片段的存在。FT-qPCR結(jié)果表明,與未攻毒的對(duì)照組相比,AJV-HF211毒株感染可誘導(dǎo)雞體內(nèi)MDA5. NLRP3及其下游caspase-1、IL-1β 和 IL-18基因的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度增加,而IFN-β和IFN-γ的表達(dá)無(wú)明顯變化。其中,NLRP3/caspase-1在1-3 dpi表達(dá)變化不明顯,而在5-7 dpi時(shí)明顯升高(p0.01),在9dpi開始下降；IL-1β、IL-18 在 1-5dpi無(wú)明顯變化,在7-17dpi表達(dá)量明顯升高(p0.05)。這表明炎癥初期NLRP3轉(zhuǎn)錄水平顯著增加,且變化趨勢(shì)和caspase-1、IL-1β和IL-18基因基本一致。MDA5在1-5dpi時(shí)變化不明顯,但在7-17dpi保持較高轉(zhuǎn)錄水平趨勢(shì)。上述結(jié)果提示,NLRP3/ caspase-1炎癥通路和MDA5受體在AJV-HF211感染早期可能發(fā)揮重要作用,而AJV-HF211毒株可能通過負(fù)向調(diào)控干擾素誘生機(jī)制逃逸免疫應(yīng)答。最后,將雞飼養(yǎng)至240日齡,觀察腫瘤發(fā)生情況,并取肝臟組織制作石蠟切片,HE染色觀察細(xì)胞狀態(tài)。結(jié)果表明,AJV-HF211毒株感染部分雞精神萎靡,食欲不振,羽毛蓬亂,伴有腹瀉消瘦,貧血等癥狀；剖檢觀察到肝臟、心臟、卵巢均有實(shí)質(zhì)性增生物出現(xiàn)。石蠟切片HE染色結(jié)果表明,攻毒組肝臟有明顯的腫瘤灶,表現(xiàn)為髓細(xì)胞瘤和血管瘤。此外,還可見淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞索消失,細(xì)胞核崩解等病理變化。上述結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)室AJV-HF211分離毒株經(jīng)人工感染可對(duì)部分感染雞具有致瘤性,其致瘤作用可能與雞本身抗性有關(guān)。綜上所述,AJV-HF211毒株感染早期和后期均可導(dǎo)致病雞發(fā)生明顯病變,并具有致瘤性。在感染早期時(shí)可誘導(dǎo)MDA5 及 NLRP3/caspase-1炎癥通路的明顯上調(diào),但I(xiàn)FN-β 和 IFN-γ誘生受阻,這可能與ALV-J免疫逃逸有關(guān)。
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圖片說(shuō)明： 失ＲＩＧ－Ｉ［巧。基于雞先天性缺失ＲＩＧ－Ｉ基因，ＲＩＧ－Ｉ或ＭＤＡ５缺陷小鼠都對(duì)ＲＮＡ逡逑病毒感染更敏感。一些研究者認(rèn)為雞會(huì)更容易感染ＡＩＶ，另外一些研究者則認(rèn)為逡逑ＲＩＧ－Ｉ樣受體家族的ＭＤＡ５會(huì)在功能上彌補(bǔ)這個(gè)缺失。有研究顯示，ＭＤＡ５的逡逑大量表達(dá)可誘導(dǎo)ＩＦＮ－Ｐ的表達(dá)，且呈正相關(guān)口３］。逡逑７．１．１邋ＭＤＡ５介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路逡逑ＭＤＡ５既可Ｗ識(shí)別單鏈ＲＮＡ又可識(shí)別雙鏈ＲＮＡ病毒，當(dāng)病毒侵入宿主細(xì)逡逑胞后，分別被ＲＩＧ－Ｉ和ＭＤＡ５識(shí)別，隨后都必需通過定位在線粒體上一重要接逡逑頭蛋白線粒體抗病毒信號(hào)分子ＭＡＶＳ（也稱作ＩＰＳ－１、ＣＡＲＤＩＦ和ＶＩＳＡ）激活下游逡逑通路致使ＩＲＦ３發(fā)生x鎪嶧�并活化Ｍ。ＭＡ｀崜砟Ｎ末端含有ＣＡ＿b慕峁褂潁�介辶x系劑擻耄遙蹋遙簀澹茫粒遙慕峁褂虻南嗷プ饔�，Ｃ末端结构域使ＭＡ｀崅颞屋x諳吡Ｌ逋忮義夏ど希�线粒体定螝g裕停粒鄭有惺構(gòu)δ苤涼刂匾�綌Q＃停粒鄭誘心跡裕遙粒疲�，招募到辶x希停粒鄭由系模裕遙粒疲撤⑸�Ｋ６３螠o�綋砟泛素化，，进而招募并激涣`っ福裕攏耍焙灣義希桑耍耍�ｉ对Ｉ＿b疲常�Ｉ＿b疲方�行y酸化活化修飾，活化的ＩＲＦ３／ＩＲＦ７轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，啟逡逑動(dòng)Ｉ型干擾素的產(chǎn)生（圖巧。逡逑旅邐ＲＮＡ逡逑？ｖ腿邋＊？＞＊ｔｋ＊＞＊
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