發(fā)布時(shí)間：2019-07-10 16:47

【摘要】：口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物發(fā)生的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。由于FMDV變異快、血清型多,通過(guò)疫苗免疫單一手段難以有效防控。因此,需要探索包括天然免疫在內(nèi)的多種途徑,綜合防控口蹄疫。天然免疫特別是抗病毒基因是阻止病毒感染的第一道防線。病毒入侵宿主細(xì)胞后,病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素(IFN),I-IFN和III-IFN在抗病毒感染的先天免疫過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,能啟動(dòng)、激活Mx(Myxovirus-resistant)等抗病毒通路。研究表明,Mx蛋白可直接作用于多種RNA病毒和DNA病毒,具有天然的抗病毒功能,在天然免疫研究領(lǐng)域具有十分重要的地位。然而,牛Mx1抗FMDV作用尚不清楚。本研究利用過(guò)表達(dá)和基因沉默技術(shù),發(fā)現(xiàn)牛Mx1具有抗FMDV活性,并從牛Mx1對(duì)FMDV基因組RNA復(fù)制及其作用病毒蛋白兩個(gè)層面探討了牛Mx1抗FMDV的分子機(jī)制,主要試驗(yàn)結(jié)果如下:1.建立牛Mx1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系BHK21-Mx1,免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證牛Mx1在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá),牛Mx1具有抗FMDV活性。利用RT-PCR方法擴(kuò)增到牛Mx1基因,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Mx1,真核表達(dá)的Mx1蛋白帶有Flag標(biāo)簽;pcDNA3.1-Mx1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,瞬時(shí)表達(dá)量高;再將pcDNA3.1-Mx1和空載pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染FMDV的易感細(xì)胞BHK-21,經(jīng)G418篩選,獲得單克隆細(xì)胞,對(duì)克隆細(xì)胞進(jìn)行半跨越PCR、Western blot鑒定,篩選出高表達(dá)牛Mx1的克隆,經(jīng)傳代60d以上,仍保持Mx1高表達(dá)狀態(tài),獲得穩(wěn)定表達(dá)牛Mx1的細(xì)胞系BHK21-Mx1及對(duì)照細(xì)胞BHK21-3.1;利用Flag單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光染色,牛Mx1蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi);將穩(wěn)定表達(dá)牛Mx1細(xì)胞系BHK21-Mx1感染FMDV,48h內(nèi)能抵御FMDV 100TCID50的攻擊,BHK21-Mx1的細(xì)胞病毒液的TCID50比對(duì)照組BHK21-3.1降低10倍以上。結(jié)果表明,牛Mx1可抑制FMDV的復(fù)制與增殖,牛Mx1具有抗FMDV功能。2.利用FMDV天然易感細(xì)胞模型,建立沉默牛Mx1的牛胎兒原代氣管上皮細(xì)胞,反向驗(yàn)證了牛Mx1具有抗FMDV功能。針對(duì)牛Mx1基因編碼區(qū),設(shè)計(jì)、合成shRNA引物,構(gòu)建慢病毒H1重組載體;將構(gòu)建的shRNA重組載體分別與pcDNA3.1-Mx1載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,Western blot檢測(cè)牛Mx1的表達(dá),篩選出對(duì)牛Mx1干擾效率最高的載體;再轉(zhuǎn)染牛胎兒原代氣管上皮細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞分選,獲得GFP陽(yáng)性細(xì)胞,有限稀釋法培養(yǎng)細(xì)胞,對(duì)培養(yǎng)10d以上的表達(dá)GFP的克隆細(xì)胞,進(jìn)行PCR和Western blot檢測(cè),獲得沉默牛Mx1的細(xì)胞BTPE-siMx1及對(duì)照細(xì)胞BPTE-LacZ;利用熒光定量RT-PCR方法,確定牛胎兒原代氣管上皮細(xì)胞的α-IFN誘導(dǎo)終濃度1×104IU/ml、誘導(dǎo)時(shí)間為6h,牛Mx1表達(dá)量最高;進(jìn)行100TCID50的FMDV感染,發(fā)現(xiàn)沉默Mx1細(xì)胞系BPTE-siMx1培養(yǎng)物的FMDV滴度顯著高于對(duì)照細(xì)胞BPTE-LacZ。結(jié)果表明,沉默牛Mx1促進(jìn)了FMDV的增殖,從反向驗(yàn)證了牛Mx1具有抗FMDV功能。3.建立FMDV鏈特異性熒光定量RT-PCR(ssqRT-PCR)檢測(cè)方法,對(duì)FMDV基因組RNA定量分析,發(fā)現(xiàn)牛Mx1能抑制FMDV基因組RNA的復(fù)制。通過(guò)比對(duì)FMDV基因組序列,確定保守的基因序列,引入非病毒的標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)分別擴(kuò)增FMDV正鏈和負(fù)鏈RNA引物,建立了FMDV ssqRT-PCR熒光定量檢測(cè)方法,具有較好的靈敏性、特異性、重復(fù)性;在FMDV感染8h、16h、24h后,過(guò)表達(dá)牛Mx1細(xì)胞BHK21-Mx1的正鏈RNA拷貝數(shù)比對(duì)照細(xì)胞BHK21-3.1高20倍、34倍和22倍,同時(shí)BHK21-Mx1細(xì)胞的負(fù)鏈RNA拷貝數(shù)比對(duì)照細(xì)胞BHK21-3.1高為12倍、19倍和17倍;而牛Mx1沉默細(xì)胞BPTE-siMx1正鏈RNA的拷貝數(shù)比對(duì)照細(xì)胞BPTE-Lac Z高29倍、47倍和14倍,同時(shí)BPTE-siMx1細(xì)胞的負(fù)鏈RNA的拷貝數(shù)比對(duì)照細(xì)胞BPTE-LacZ高為24倍、32倍和14倍。結(jié)果表明,牛Mx1可抑制FMDV基因組RNA的復(fù)制。4.原核表達(dá)FMDV的P1、P2、P3蛋白,制備兔抗血清,Western blot檢測(cè)到在牛Mx1作用下2C蛋白量降低;利用GST pull-down和免疫共沉淀方法,確認(rèn)牛Mx1可作用于FMDV 2C蛋白的N端,發(fā)揮抗病毒功能。成功構(gòu)建了FMDV的P1、P2、P3基因的pET32a原核表達(dá)載體,并純化到相應(yīng)的蛋白,制備了兔多克隆抗體;Western blot技術(shù)檢測(cè),FMDV感染牛Mx1穩(wěn)定細(xì)胞系BHK21-Mx1的細(xì)胞培養(yǎng)物,與對(duì)照細(xì)胞相比,2C蛋白量顯著降低;成功構(gòu)建了帶有GST標(biāo)簽的牛Mx1和2C的原核表達(dá)載體,并純化到相應(yīng)蛋白,通過(guò)GST pull-down實(shí)驗(yàn),表明牛Mx1可與FMDV 2C結(jié)合;成功構(gòu)建了帶有HA標(biāo)簽的pcDNA3.1-2C載體,與pcDNA3.1-Mx1共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,免疫共沉淀正反兩方向都證實(shí)了牛Mx1蛋白和FMDV2C蛋白發(fā)生相互作用。通過(guò)構(gòu)建表達(dá)2C蛋白缺失突變體,發(fā)現(xiàn)牛Mx1可能作用于FMDV2C蛋白的N端。
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圖片說(shuō)明：人MxA蛋白和人類(lèi)動(dòng)素蛋白的結(jié)構(gòu)域模式圖
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圖片說(shuō)明：不同物種的Mx蛋白進(jìn)化樹(shù)分析
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2512742