發(fā)布時間：2019-07-04 07:00

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種傳染病,該病的主要特征是母豬出現(xiàn)繁殖障礙以及仔豬出現(xiàn)嚴重的呼吸道癥狀。自1987年在美國首次發(fā)現(xiàn)以來,在全球主要養(yǎng)豬國家廣泛流行。1996年郭寶清等從豬場流產(chǎn)胎兒分離出該病毒,證實了我國存在PRRS的流行。在此后的時間里,該病在國內(nèi)大部分地區(qū)流行并在部分地區(qū)呈上升趨勢,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。研究表明,該病毒感染機體后能夠引起免疫抑制,形成持續(xù)性感染,具有抗體依賴性增強作用,并且病毒基因組遺傳變異顯著。病毒基因組編碼的蛋白可劃分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白的功能主要作用在病毒RNA復制合成階段并能夠調(diào)控宿主對病毒的免疫反應(yīng)過程。非結(jié)構(gòu)蛋白1α (nsp1α)含有鋅指結(jié)構(gòu)域、木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶活性區(qū)域、C-末端延伸區(qū)等區(qū)域,能夠抑制I-干擾素產(chǎn)生,在PRRSV逃逸機體免疫的過程中起到重要的作用。本研究擴增出nsp1α基因片段,構(gòu)建原核重組質(zhì)粒,表達重組蛋白作為免疫原,免疫動物后獲得多克隆抗體及單克隆抗體。實驗內(nèi)容主要包括：1、PRRSV nsp1α原核表達及多克隆抗體的制備以真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-nsp1α為模板,擴增出nsp1α片段,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET32a-nsp1α,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)并優(yōu)化培養(yǎng)條件。在37℃條件下,1mM誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達4h,菌液超聲破碎后SDS-PAGE電泳表明重組蛋白以包涵體形式大量表達;大量誘導菌液并超聲破碎,高速離心后得到包涵體,經(jīng)過一系列緩沖液洗滌后用8M尿素緩沖液溶解包涵體,復性的包涵體作為免疫原免疫新西蘭大白兔。免疫三次后,以包涵體復性液作為包被抗原,間接ELISA檢測兔多克隆抗體血清,血清效價達到1：2048000以上。2、PRRSV nsp1α原核表達及單克隆抗體的制備以真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-nsp1α為模板,擴增出nsp1α片段,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28a-nsp1α,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3),在37℃條件下,1 mM誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達6h, SDS-PAGE蛋白電泳表明重組蛋白以包涵體形式大量表達,用8M尿素緩沖液溶解包涵體后,采用透析復性；復性的重組蛋白包被ELISA板,間接ELISA表明重組蛋白能夠識別豬PRRSV陽性血清與陰性血清,具有較好的免疫學反應(yīng)活性；重組蛋白免疫BALA/c小鼠,三次免疫后加強免疫一次,取小鼠脾臟細胞與SP2/0瘤細胞融合,以pET28a-nsp1α重組蛋白作為包被抗原,間接ELISA初次篩選陽性融合細胞,間接免疫熒光試驗進一步篩選,最后得到穩(wěn)定分泌nsp1α抗體的雜交瘤細胞；雜交瘤細胞注射小鼠腹腔,一周后收集腹水,間接ELISA檢測效價達到1：512000。上述制備的nspla多克隆抗體和單克隆抗體進行Western blot、間接免疫熒光及免疫組化實驗,均能夠特異性識別真核重組蛋白pcDNA3.1-nsp 1α以及PRRSV BJ4株nspla天然蛋白。這為研制基于nspla檢測的PRRSV診斷方法以及進一步研究nspla功能提供了研究基礎(chǔ)。
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【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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本文編號：2509722