發(fā)布時(shí)間：2018-02-27 18:09

  本文關(guān)鍵詞： 干擾 素和 分泌 IL-10 細(xì)胞 新生 炎癥 反應(yīng) 調(diào)控　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 前言 新生期(neonatal period)指的是動(dòng)物剛出生后的一段時(shí)間,人類為0至28天,而小鼠為0至7天。新生期動(dòng)物的一大特征是對(duì)病原微生物高度易感,獲得性免疫應(yīng)答(adaptive immune response)表現(xiàn)為抗體應(yīng)答水平低,T細(xì)胞免疫通常偏向Th2途徑。獲得性免疫應(yīng)答低下被認(rèn)為是新生期動(dòng)物對(duì)病原微生物高度易感一個(gè)因素,但其重要性及是否存在其它機(jī)制尚有待于進(jìn)一步闡明。天然免疫(innate immunity)是抵抗外源微生物入侵的第一道防線,在抗感染免疫的早期起關(guān)鍵作用,同時(shí)天然免疫處于獲得性免疫的上游,不但為激活獲得性免疫所必需,而且決定獲得性免疫的方向和強(qiáng)度。天然免疫的啟動(dòng)是天然免疫細(xì)胞通過模式識(shí)別受體識(shí)別病原微生物中保守的分子配體而實(shí)現(xiàn)的,其中Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是最重要的一類受體。目前對(duì)新生期天然免疫的研究較少,且缺乏系統(tǒng)性,新生期天然免疫功能是否正常還存有爭(zhēng)議。本文以新生期小鼠為研究對(duì)象,應(yīng)用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)新生期天然免疫系統(tǒng)進(jìn)行了比較全面的研究,證明了新生期天然免疫細(xì)胞在TLR配體的刺激下功能正常,揭示了CD5~+ B細(xì)胞對(duì)其它天然免疫細(xì)胞炎性應(yīng)答負(fù)調(diào)控的新機(jī)制,該機(jī)制為新生期動(dòng)物對(duì)病原微生物高度敏感的原因提供了新的可能解釋。 1新生期小鼠對(duì)TLR配體的炎性應(yīng)答 首先測(cè)定了新生期小鼠在注射TLR配體后體內(nèi)的炎性應(yīng)答,同時(shí)以成年鼠組作為對(duì)照。注射TLR9配體CpG后,從成年鼠的脾臟和肝臟中可檢測(cè)出高水平的炎性細(xì)胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-12),而在新生期小鼠的相應(yīng)器官未能或僅能檢測(cè)到很低水平的炎性細(xì)胞因子。與此對(duì)應(yīng)的是,絕大多數(shù)成年鼠死于D-氨基半乳糖(D-galactosamine)預(yù)致敏的、CpG誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),而新生期小鼠卻在攻擊后存活。采用其它TLR配體(Pam3CSK4[TLR2-L],Poly I:C[TLR3-L],LPS[TLR4-L]和R848[TLR7-L])也得到類似的結(jié)果,這說明與成年鼠相比,新生期小鼠在體內(nèi)炎性應(yīng)答方面存在缺陷。在本實(shí)驗(yàn)條件下,炎性細(xì)胞因子主要由天然免疫系統(tǒng)的樹突細(xì)胞(dendriticcells,DC)和CDl1b~+氃系細(xì)胞(myeloid cells,包括單核細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,粒細(xì)胞等)產(chǎn)生。為研究新生期小鼠的這些天然免疫細(xì)胞是否存在功能上的缺陷,采用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色或純化細(xì)胞的方法,測(cè)定了新生期常規(guī)樹突細(xì)胞(conventional dendritic cells,cDC)、漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells,pDC)和CDl1b~+髓系細(xì)胞在TLR配體刺激下分泌炎性細(xì)胞因子的能力。結(jié)果在這些體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),與成年鼠相比,新生期天然免疫細(xì)胞功能上并不存在缺陷,刺激后可分泌正常水平的炎性細(xì)胞因子。 白介素10(interleukin 10,IL-10)是最重要的炎性負(fù)調(diào)節(jié)分子之一。在CpG誘導(dǎo)的休克模型中,IL-10缺失的新生期小鼠顯示與野生型成年鼠相似的高敏感性,并在體內(nèi)產(chǎn)生高水平的炎性細(xì)胞因子,這說明在新生期這個(gè)階段,小鼠在體內(nèi)炎癥誘導(dǎo)方面不存在發(fā)育上的缺陷。 以上結(jié)果提示:新生期小鼠天然免疫細(xì)胞本身功能正常,但在體內(nèi)存在著對(duì)這些天然免疫細(xì)胞炎性反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制,并且IL-10可能起關(guān)鍵作用。 2新生期CD5~+ B細(xì)胞對(duì)新生期小鼠炎癥反應(yīng)的抑制 IL-10缺失的新生期小鼠對(duì)CpG的高敏感性說明了體內(nèi)產(chǎn)生的IL-10對(duì)炎性反應(yīng)控制的重要性。前期的研究發(fā)現(xiàn),在CpG刺激下,小鼠新生期CD5~+ B細(xì)胞是抗炎細(xì)胞因子IL-10的主要來源。新生期CD5~+ B細(xì)胞占全部B細(xì)胞的15%～30%,而這類細(xì)胞在成年鼠B細(xì)胞中的比例小于2%。除CpG外,CD5~+ B細(xì)胞也在其它TLR配體Pam3CSK4,LPS和R848刺激下產(chǎn)生大量的IL-10。體外共培養(yǎng)試驗(yàn)證明,來自于CD5~+ B細(xì)胞的IL-10抑制了新生期cDC,pDC和CD11b~+氃系細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的能力,而且這種抑制不依賴于細(xì)胞間的直接接觸。 分泌IL-10的CD5~+ B細(xì)胞抑制新生期炎性應(yīng)答的重要性進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。B細(xì)胞或CD5~+ B細(xì)胞缺失的新生期小鼠在注射CpG后,體內(nèi)的炎性細(xì)胞因子水平上升,并且恢復(fù)了對(duì)D-氨基半乳糖預(yù)致敏的休克模型的敏感性。在預(yù)先接受新生期B細(xì)胞或CD5~+ B細(xì)胞輸注后,IL-10缺失或B細(xì)胞缺失的新生期小鼠能夠免于CpG誘導(dǎo)的休克反應(yīng)。因此,分泌IL-10的CD5~+ B細(xì)胞在體內(nèi)控制了新生期小鼠的炎癥反應(yīng)。 3Ⅰ型干擾素通過分泌IL-10的CD5~+ B細(xì)胞控制新生期炎癥反應(yīng) 在新生期小鼠pDC與CD5~+ B細(xì)胞的共培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在CpG和R848刺激下,除了B細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10顯著抑制了pDC分泌Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)和其它炎性細(xì)胞因子外,CD5~+ B細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10顯著高于CD5~+ B細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的水平。這說明pDC促進(jìn)了B細(xì)胞IL-10的分泌。在所測(cè)定的pDC產(chǎn)生的細(xì)胞因子中,只有IFN-α和IFN-β顯著提高CpG刺激下新生期B細(xì)胞IL-10的分泌。當(dāng)pDC與Ⅰ型干擾素受體缺失的新生期B細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),pDC失去增強(qiáng)新生期B細(xì)胞分泌IL-10的能力,證實(shí)pDC產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素是促進(jìn)B細(xì)胞IL-10產(chǎn)生的關(guān)鍵分子。cDC和氃系細(xì)胞以相同的機(jī)制通過分泌Ⅰ型干擾素來增加B細(xì)胞IL-10的產(chǎn)生。 為進(jìn)一步研究Ⅰ型干擾素在新生期炎性應(yīng)答中的作用,測(cè)定了Ⅰ型干擾素受體缺失的小鼠體內(nèi)的炎性應(yīng)答。與野生型新生期小鼠相比,Ⅰ型干擾素受體缺失的新生期小鼠在注射CpG后產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng),并且恢復(fù)對(duì)D-氨基半乳糖預(yù)致敏的休克模型的敏感性。相反的現(xiàn)象卻出現(xiàn)在成年鼠,Ⅰ型干擾素受體缺失的成年鼠比正常對(duì)照組產(chǎn)生顯著減弱的炎癥反應(yīng),并且對(duì)CpG引發(fā)的休克模型不敏感。這說明Ⅰ型干擾素在成年期促進(jìn)而在新生期抑制炎癥反應(yīng)。 Ⅰ型干擾素在新生期對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制依賴于CD5~+ B細(xì)胞和IL-10的存在,因?yàn)樵谌狈�CD5~+ B細(xì)胞或IL-10的情況下,Ⅰ型干擾素促進(jìn)新生期炎性應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)只有野生型新生期小鼠B細(xì)胞,而不是Ⅰ型干擾素受體缺失的新生期小鼠B細(xì)胞可以保護(hù)IL-10缺失的新生期小鼠免于CpG誘導(dǎo)的致死性休克,從而進(jìn)一步說明Ⅰ型干擾素在體內(nèi)通過增強(qiáng)B細(xì)胞產(chǎn)生ILL-10來控制新生期小鼠的炎癥反應(yīng)。 結(jié)論 新生期屬于一個(gè)特別的時(shí)期,一方面,生長代謝旺盛且許多器官的發(fā)育還不完善,需要一個(gè)穩(wěn)定的生長環(huán)境。許多研究表明,這個(gè)時(shí)期的炎癥反應(yīng)將導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩,嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。新生期面對(duì)大量的外源微生物,需要迅速建立針對(duì)這些炎癥誘導(dǎo)物的耐受,以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。另一方面,新生期的炎癥反應(yīng)應(yīng)答低下將導(dǎo)致不能有效清除病原微生物,從而造成對(duì)病原微生物的高度敏感。本研究表明,新生期小鼠的天然免疫細(xì)胞在功能上不存在缺陷,在TLR配體的刺激后可產(chǎn)生正常的炎性應(yīng)答,但是這種能力在體內(nèi)卻被一群分泌IL-10,具有負(fù)調(diào)節(jié)功能的CD5~+ B細(xì)胞亞群所控制,這種控制是受發(fā)育調(diào)控的,因?yàn)樾律�期是CD5~+ B細(xì)胞亞群發(fā)生的高峰期,隨著小鼠的生長,CD5~+ B細(xì)胞的產(chǎn)生逐漸減少。另一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)是,Ⅰ型干擾素顯著增加CD5~+ B細(xì)胞IL-10的分泌,而且在體內(nèi)CD5~+ B細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)作用依賴于Ⅰ型干擾素的存在,揭示了炎性應(yīng)答啟動(dòng)后機(jī)體的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。因此,Ⅰ型干擾素及分泌IL-10的CD5~+ B細(xì)胞對(duì)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的控制保證了小鼠在新生期生長發(fā)育環(huán)境的穩(wěn)定,但另一方面也可能會(huì)導(dǎo)致它們對(duì)病原微生物抵抗力的下降。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R363

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