發(fā)布時(shí)間：2018-02-26 10:41

  本文關(guān)鍵詞： 腸球菌 耐藥 慶大霉素高水平耐藥 萬古霉素耐藥腸球菌 氨基糖苷類修飾酶 質(zhì)粒 轉(zhuǎn)座子　出處：《浙江大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 腸球菌作為一種條件致病菌己成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一，是引起心內(nèi)膜炎、菌血癥和尿路感染的重要致病菌。臨床上常采用細(xì)菌細(xì)胞壁活性抗菌藥物和氨基糖苷類抗生素聯(lián)合來治療腸球菌感染，但當(dāng)腸球菌產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶后會(huì)對(duì)高濃度氨基糖苷類產(chǎn)生耐藥性，而在耐藥菌株中慶大霉素高水平耐藥(high-levelgentamicin resistance，HLGR)占了較大的比例，從而失去與細(xì)菌細(xì)胞壁活性抗菌藥物的協(xié)同作用，加大了治療的難度。特別是近年出現(xiàn)的萬古霉素耐藥腸球菌(vancomycin resistant enterococcus，VRE)給臨床治療造成困難，引起廣泛重視。 HLGR的出現(xiàn)系氨基糖苷類修飾酶所致，修飾酶的產(chǎn)生可使青霉素或糖肽類與氨基糖苷類的協(xié)同作用消失，并可致多重耐藥。慶大霉素耐藥主要是由腸球菌中的耐藥基因aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia編碼一種修飾酶AAC(6’)-Ie-APH(2”)-Ia引起。該修飾酶可介導(dǎo)對(duì)除鏈霉素以外的幾乎所有臨床使用的氨基糖苷類抗生素的抗性，并可使青霉素或糖肽類與氨基糖苷類的協(xié)同作用消失。另外還有新出現(xiàn)由aph(2”)-Ic、aph(2”)-Id及aph(2”)-Ib基因編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(2”)-Ic、APH(2”)-Id和APH(2”)-Ib。APH(2”)-Ic使腸球菌對(duì)慶大霉素呈中等水平耐藥，并破壞慶大霉素的協(xié)同作用。APH(2”)-Id和APH(2”)-Ib可導(dǎo)致對(duì)鏈霉素以外氨基糖苷類的高水平耐藥，但并不消除阿米卡星與細(xì)胞壁活性藥物的協(xié)同作用。已有報(bào)道，腸球菌的慶大霉素高水平耐藥基因aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia及aph(2”)-Ic基因等大多位于可接合的較大的質(zhì)粒上，也有位于接合轉(zhuǎn)座子上或不可轉(zhuǎn)移的染色體上，有些轉(zhuǎn)座子還可插入質(zhì)粒中和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移或誘動(dòng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。因此，上述耐藥基因的檢測(cè)有助于預(yù)測(cè)氨基糖苷類抗生素與細(xì)胞壁活性藥物合用的療效，而耐藥傳播機(jī)制的研究將有助于對(duì)耐藥性播散的控制。 腸球菌對(duì)萬古霉素的耐藥可分為低水平耐藥(MIC 8-32μg／ml)和高水平耐藥(MIC≥64μg／ml)。根據(jù)腸球菌對(duì)萬古霉素和替考拉寧的不同耐藥水平及耐藥的誘導(dǎo)性，VRE分為6個(gè)表型，分別是VanA、VanB、VanC(C1、C2、C3)、VanD、VanE、VanG。其中以VanA和VanB型最為多見。萬古霉素與腸球菌細(xì)胞壁上的五肽肽糖前體的羧基末端D-丙氨酸-D-丙氨酸結(jié)合形成復(fù)合體，阻止肽糖聚合所需的轉(zhuǎn)糖基和轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，從而抑制腸球菌的細(xì)胞壁生物合成。而在萬古霉素耐藥腸球菌(VRE)的細(xì)胞壁肽糖前體末端的D-丙氨酸-D-丙氨酸發(fā)生了改變，萬古霉素不能與之相結(jié)合，因此不能抑制VRE的細(xì)胞壁合成。VanA耐藥常常與Tn1546樣元件同時(shí)存在。VanA型基因在不同的菌株間是高度保守的，但在Tn1546的整體結(jié)構(gòu)上，已發(fā)現(xiàn)有大量變異。許多變異歸因于轉(zhuǎn)座子內(nèi)不同插入序列(IS)元件的插入以及它們所引起的序列刪除。Tn1546因存在于接合性質(zhì)粒上而得到廣泛播散。 腸球菌是臨床較常見的一類細(xì)菌。近年來抗菌藥物的廣泛應(yīng)用以及各種侵入性醫(yī)用裝置的使用，使得腸球菌所致的醫(yī)院感染逐漸增多。由于腸球菌對(duì)抗生素的耐藥性增加，尤其是HLGR及VRE的分離率在國(guó)內(nèi)迅速上升，給臨床治療造成了更大的難題。本研究分析了臨床分離到的HLGR、VRE菌株的克隆相關(guān)性、耐藥性、耐藥基因及耐藥傳播機(jī)制，為HLGR、VRE感染的防治提供基礎(chǔ)。深入了解腸球菌的耐藥機(jī)制及耐藥性的傳遞特性，對(duì)于指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物和防止耐藥株的流行有著重要的意義。 1．腸球菌耐藥性研究 收集2002年6月～2003年5月我院臨床分離的腸球菌106株。其中分離自腹腔引流液的最多，占26.4％(28／106)；其次分離自膽汁，占20.8％(22／106)；尿來源的居第三位，占18.9％(20／106)；血液來源居第四位，占17.0％(18／106)。提示腸球菌所致的感染中，以腹腔感染最常見，其次為膽道感染、泌尿系統(tǒng)感染及菌敗血癥。在所分離的腸球菌中，糞腸球菌和屎腸球菌的分離率最高，分別為45.3％(48／106)和43.4％(46／106)，共占總數(shù)的88.7％。采用K-B法及瓊脂稀釋法測(cè)定106株腸球菌對(duì)13種抗菌藥物的耐藥性，發(fā)現(xiàn)對(duì)利奈唑胺、萬古霉素、替考拉寧沒有耐藥株；屎腸球菌對(duì)β—內(nèi)酰胺類抗生素、喹諾酮類藥物的耐藥率明顯高于糞腸球菌；奎奴普�。�達(dá)福普汀對(duì)糞腸球菌的作用差，而對(duì)屎腸球菌有較強(qiáng)作用。所有腸球菌經(jīng)頭孢硝噻吩紙片法檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)β—內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株，推測(cè)本院腸球菌對(duì)β—內(nèi)酰胺類抗生素耐藥主要是由于低親和力的青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的過量產(chǎn)生。采用瓊脂篩選法篩選出氨基糖苷類高水平耐藥的腸球菌(HLAR)78株，占73.6％，其中HLGR占64.2％(68／106)，HLSR占45.3％(48／106)。 2．慶大霉素高水平耐藥腸球菌耐藥基因及同源性研究 PCR檢測(cè)出68株HLGR中63株aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia基因陽(yáng)性，占92.6％；3株存在與aph(2”)-Id高同源性的基因。50株住院病人分離的HLGR中，屎腸球菌的PFGE圖譜有8型(A—H)，以A型為主；糞腸球菌的PFGE圖譜有4型(A—D)，呈多克隆散發(fā)。提示HLGR已成為醫(yī)院感染的重要耐藥菌，主要通過aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia基因編碼的修飾酶造成對(duì)慶大霉素高度耐藥。 3．新氨基糖苷類抗生素耐藥基因及傳播機(jī)制研究 鉛黃腸球菌HZ95為瓊脂稀釋法篩選所得的慶大霉素高水平耐藥菌株(HLGR)，于2002年7月由我院一位ICU住院病人腹腔引流液中分離得到的。本研究通過原始耐藥菌HZ95質(zhì)粒抽提并酶切克隆測(cè)序及Southern雜交發(fā)現(xiàn)了與aph(2”)-Id基因高度同源(核苷酸同源性為96.1％，氨基酸同源性為93.7％)的慶大霉素高水平耐藥新編碼基因aph(2”)-Ie基因(GenBank登錄號(hào)AY 677166)位于一約16kb大小的質(zhì)粒上。在aph(2”)-Ie基因的下游發(fā)現(xiàn)存在另一耐藥基因鏈霉素腺苷轉(zhuǎn)移酶str基因，屬于aad基因家族。該基因?qū)е聦?duì)鏈霉素及大觀霉素的耐藥，與腸球菌中3’-鏈霉素腺苷轉(zhuǎn)移酶(aadE)基因同源性較高，，在乳酸乳球菌、金黃色葡萄球菌等中有報(bào)道，但在腸球菌中卻未見報(bào)道。質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白repD存在于兩個(gè)耐藥基因之間。耐藥基因可以通過整合子、轉(zhuǎn)座子、插入序列及某些未知的轉(zhuǎn)移機(jī)制在質(zhì)粒間、質(zhì)粒與染色體間轉(zhuǎn)移或集聚重排。本研究發(fā)現(xiàn)在aph(2”)-Ie基因讀碼框的上游存在與IsEcp1高度相似的插入序列，含有轉(zhuǎn)座酶TnpA。該酶能夠特異識(shí)別和接合轉(zhuǎn)座子與靶點(diǎn)序列，可和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移或誘動(dòng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。提示HLGR也可由一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的APH(2”)-Ie氨基糖苷類修飾酶所引起。aph(2”)-Ie通過轉(zhuǎn)座酶與其他耐藥基因一起由質(zhì)粒傳播。 4．萬古霉素耐藥腸球菌耐藥基因及傳播機(jī)制研究 2006年5月～2007年4月在杭州市四家醫(yī)院收集到臨床分離的萬古霉素耐藥腸球菌16株耐藥表型均符合VanA型，基因型證實(shí)均為VanA型。多對(duì)引物對(duì)轉(zhuǎn)座子的不同區(qū)域的PCR擴(kuò)增并進(jìn)行序列拼接、比對(duì)，發(fā)現(xiàn)VRE ZY21237的VanA基因位于轉(zhuǎn)座子Tn1546上，其它15株VRE菌株的VanA基因周圍序列與Tn1546相似，是一種未報(bào)道的Tn1546類似轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。其中新的編碼轉(zhuǎn)座酶的插入序列(IS1485)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座功能。臨床分離的16株VRE菌株vanA基因均可通過濾膜接合進(jìn)行轉(zhuǎn)移。VRE菌株均由VanA基因所引起，可通過轉(zhuǎn)座子Tn1546與Tn1546類似轉(zhuǎn)座子在不同菌株或菌種之間進(jìn)行傳播。杭州市四家醫(yī)院分離的16株VRE菌株屬于7個(gè)不同型，并非單克隆播散，其中14株屬于適應(yīng)醫(yī)院環(huán)境的克隆復(fù)合體(Clonal Complex17，CC17)。 以上研究表明： 1．HLGR已成為醫(yī)院感染的重要耐藥菌，主要通過aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia基因編碼的修飾酶造成對(duì)慶大霉素高度耐藥。 2．住院病人分離的HLGR脈沖凝膠電泳分析，屎腸球菌HLGR主要為單克隆播散；糞腸球菌HLGR則呈多克隆散發(fā)。 3．新的慶大霉素高水平耐藥編碼基因aph(2”)-Ie基因(GenBank登錄號(hào)AY677166)與aph(2”)-Id基因高度同源(核苷酸同源性為96.1％，氨基酸同源性為93.7％)，可通過轉(zhuǎn)座酶與其他耐藥基因一起由質(zhì)粒傳播。 4．16株臨床分離的VRE菌株基因型及表型均為VanA型，通過轉(zhuǎn)座子Tn1546與Tn1546類似轉(zhuǎn)座子在不同菌株或菌種之間進(jìn)行傳播。其中14株屬于適應(yīng)醫(yī)院環(huán)境的克隆復(fù)合體CC17。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：1537674