本文關(guān)鍵詞： SPLUNC1 啟動(dòng)子 增強(qiáng)子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 表達(dá)調(diào)控　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】： 惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)腫瘤是基因病，其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程是多種基因表達(dá)失常的結(jié)果，因此真正意義上的腫瘤治療也應(yīng)該、同時(shí)也必須是以修正這些發(fā)生變化的基因?yàn)榛c(diǎn)的治療手段。 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)南方及東南亞地區(qū)常見(jiàn)的一類(lèi)惡性腫瘤。鼻咽癌的發(fā)生同其他腫瘤一樣，是一個(gè)多因素參與和多階段的過(guò)程。為了研究鼻咽癌發(fā)病過(guò)程中的基因表達(dá)變化，何志巍博士通過(guò)高密度的cDNA微陣列膜比較了人正常鼻咽和鼻咽癌組織的基因差異表達(dá)譜，并從中克隆了一個(gè)表達(dá)差異具有顯著性的EST全長(zhǎng)，命名為YH1基因，GeneBank收錄號(hào)為AF158745。 YH1基因定位在染色體20q11.2，基因全長(zhǎng)約7.31kb，包括9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子；cDNA含有完整的閱讀框架，編碼一個(gè)富含亮氨酸(24.6％)、含256個(gè)氨基酸的偏酸、疏水性蛋白質(zhì)，有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)。由于其3'UTR剪切方式不同，存在2種不同的轉(zhuǎn)錄本，但編碼的蛋白質(zhì)相同。YH1基因序列與小鼠的上腭、肺及鼻咽上皮克隆(palate，lung and nasal epithelium clone，PLUNC)基因高度同源，在豬、牛、大鼠等物種中都高度保守，因而被統(tǒng)一歸結(jié)為PLUNC家族；因其分子量小，因此人PLUNC基因被命名為SPLUNC1(short plunc 1)。 SPLUNC1基因的表達(dá)具有相對(duì)的組織特異性。在成人鼻咽組織中有較強(qiáng)的表達(dá)，而在鼻咽癌細(xì)胞系及活檢組織中表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)；氣管組織中的表達(dá)水平明顯高于右心房、空腸、成人肺、唾液腺、胚胎肺組織等。此外，SPLUNC1基因的一個(gè)轉(zhuǎn)錄本LUNX在非小細(xì)胞性肺癌中表達(dá)上調(diào)，而且能在該腫瘤的早期轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中檢測(cè)到，因而LUNX被認(rèn)為是一個(gè)非小細(xì)胞性肺癌淋巴結(jié)早期轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。 SPLUNC1基因確切的生物學(xué)功能至今仍不明確。生物信息學(xué)分析顯示，該基因編碼蛋白的N-端存在一個(gè)含19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，氨基酸序列與腮腺和氣管腺上皮產(chǎn)生的分泌蛋白LCN1和腮腺分泌蛋白(parotid secretary protein)極為相似。對(duì)該蛋白三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示內(nèi)部含有一個(gè)殺菌／通透性增強(qiáng)蛋白(bactericidal／permeability-increasing protein，BPI)結(jié)構(gòu)域(BPI domain)，其三維折疊結(jié)構(gòu)與BPI折疊極為相似，而B(niǎo)PI的桶狀結(jié)構(gòu)能與細(xì)菌細(xì)胞壁上脂多糖特異性的結(jié)合，從而具有中和內(nèi)毒素及直接殺菌作用，因此推測(cè)SPLUNC1蛋白很可能是一種分泌蛋白，并具有結(jié)合細(xì)菌脂多糖、消滅細(xì)菌的功能。此：外，對(duì)SPLUNC1基因的單核苷酸多態(tài)性的研究也證實(shí)該基因的啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與NPC的易感性之間存在著聯(lián)系，是NPC發(fā)生的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因子。 基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制是后基因組時(shí)代一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容。基因的正確表達(dá)依賴(lài)于一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。啟動(dòng)子是與RNA聚合酶特異結(jié)合的DNA序列，是轉(zhuǎn)錄起始所必需的順式元件。在基因表達(dá)的調(diào)控中，特定的啟動(dòng)子起始過(guò)程常常決定某個(gè)基因是否應(yīng)當(dāng)表達(dá)。增強(qiáng)子是基因轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控順式作用元件，具有促進(jìn)啟動(dòng)子表達(dá)下游基因的作用，同其他的負(fù)調(diào)控元件和反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子)共同維護(hù)著下游基因的正確表達(dá)。不同的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)外界環(huán)境的各種刺激或不同發(fā)育階段的各種信號(hào)做出反應(yīng)，結(jié)合于轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，從而控制不同基因的表達(dá)。一個(gè)基因的正確表達(dá)依賴(lài)于順式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶三者之間的相互協(xié)同作用。在闡明基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)上，針對(duì)性地干預(yù)某些轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，逆轉(zhuǎn)基因異常表達(dá)，產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，已經(jīng)發(fā)展成為腫瘤治療的新方法。 基于人SPLUNC1基因的研究現(xiàn)狀及其在腫瘤發(fā)病機(jī)制和防治中的潛在意義，本課題的研究目的是明確人體內(nèi)表達(dá)SPLUNC1的細(xì)胞類(lèi)型，鑒定SPLUNC1的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和有關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，為深入研究SPLUNC1基因和相關(guān)調(diào)控機(jī)制、構(gòu)建組織特異性啟動(dòng)子及尋找新的治療藥物和作用靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。本課題進(jìn)行了如下研究： (一)表達(dá)SPLUNC1基因的細(xì)胞類(lèi)型的鑒定 采用原位雜交方法檢測(cè)近30種組織中SPLUNC1基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SPLUNC1在上腭、表皮、食管及食管—責(zé)門(mén)部的鱗狀上皮，鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌、食管鱗癌和肺鱗癌的腫瘤細(xì)胞，鼻咽部、氣管、宮頸部化生的鱗狀上皮中均不表達(dá)；在胃粘膜、膽囊、空腸、結(jié)腸、子宮內(nèi)膜及腺體和宮頸部的單層柱狀上皮細(xì)胞中也不表達(dá)；主要表達(dá)在鼻咽、氣管和支氣管的假?gòu)?fù)層柱狀上皮中，且沿呼吸道從上至下，該基因表達(dá)逐漸減弱，在肺組織中檢測(cè)不到其表達(dá)。在腮腺、下頜下腺的導(dǎo)管和漿液腺細(xì)胞、鼻咽、肺和食管等部位的粘膜下漿液腺細(xì)胞、胃粘膜下壁細(xì)胞及乳腺小葉和導(dǎo)管上皮中也表達(dá)SPLUNC1，而粘液腺細(xì)胞中不表達(dá)。此外，在肺、胃、結(jié)腸、乳腺、子宮內(nèi)膜和宮頸等部位的腺癌組織中，SPLUNC1基因均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。提示SPLUNC1基因很可能是一個(gè)與分化有關(guān)的基因，，而非鼻咽癌的抑癌基因，其表達(dá)具有明顯的細(xì)胞特異性。 (二)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)SPLUNC1基因表達(dá)調(diào)控元件 采用多個(gè)生物信息學(xué)軟件對(duì)SPLUNC1基因5’端-5000bp～+1000bp(以第一外顯子為+1位)序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)SPLUNC1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于-1～+10bp區(qū)域間、-29bp處存在TATA box、啟動(dòng)子位于-490～+89bp區(qū)間；在人和小鼠兩物種間該基因的-245～-1bp區(qū)間高度保守，并且存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。這些預(yù)測(cè)結(jié)果為進(jìn)一步鑒定SPLUNC1基因的調(diào)控元件、探討其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和構(gòu)建組織特異性啟動(dòng)子奠定了基礎(chǔ)，具有一定的參考價(jià)值。 (三)SPLUNC1基因5’端側(cè)翼區(qū)啟動(dòng)子活性分析 通過(guò)Real-time RT-PCR的方法檢測(cè)了肺腺癌等十一種細(xì)胞系中SPLUNC1基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在肺腺癌Glc-82細(xì)胞中該基因的表達(dá)水平最高，這為進(jìn)一步研究SPLUNC1基因的調(diào)控機(jī)制提供了合適的細(xì)胞材料。 在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以人基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增了5’端截短的P4(-3000～+100bp)、P3(-2000～+100bp)、P2(-1000～+100bp)、P1(-500bp～+100bp)和P0(-240～+100bp)等5個(gè)調(diào)控區(qū)片段。預(yù)期長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序證實(shí)后，定向連接至報(bào)告基因載體pGL3-Basic的KpnⅠ和XhoⅠ限制性?xún)?nèi)酶切位點(diǎn)上，經(jīng)雙酶切鑒定后，成功構(gòu)建了5個(gè)報(bào)告基因重組載體pGL3-P0～pGL3-P4。以pSV-β-Galactosidase質(zhì)粒為內(nèi)對(duì)照，將空載體pGL3-Basic、陽(yáng)性對(duì)照pGL3-Control和不同長(zhǎng)度調(diào)控區(qū)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Glc-82和293A細(xì)胞中，培養(yǎng)48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞裂解液中熒光素酶活性。結(jié)果顯示SPLUNC1基因不同長(zhǎng)度調(diào)控區(qū)片段的熒光素酶活性在Glc-82和293A兩種細(xì)胞中均存在差異，P0在2種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性均高于其他長(zhǎng)度的片段；在兩種細(xì)胞中，pGL3-P0的熒光素酶活性分別是空載體pGL3-Basic的5.10和2.69倍，說(shuō)明P0具有啟動(dòng)子活性，提示SPLUNC1的啟動(dòng)子可能存在于其5’端序列-240～+100bp區(qū)域中。此外，SPLUNC1基因的5個(gè)調(diào)控區(qū)片段在Glc-82細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性均高于293A細(xì)胞，提示SPLUNC1基因的啟動(dòng)子具有一定的細(xì)胞類(lèi)型特異性。 (四)SPLUNC1基因增強(qiáng)子的鑒定 以人基因組DNA為模板，采用PCR方法對(duì)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的5個(gè)增強(qiáng)子片段(E0：-158～-9bp；E1：+3770～+3959bp；E2：+2069～+2201bp；E3：+26454～+6555bp；E4：+14553～+14652bp)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序證實(shí)后，分別定向連接至報(bào)告基因載體pGL3-Promoter中SV40啟動(dòng)子上游的KpnⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)上和SV40啟動(dòng)子及報(bào)告基因下游的BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位點(diǎn)上，經(jīng)酶切鑒定后，構(gòu)建了5個(gè)報(bào)告基因重組載體pGL3-E_(0～4)-up和5個(gè)重組載體pGL3-E_(0～4)-down。以pSV-β-Galactosidase質(zhì)粒為內(nèi)對(duì)照，將空載體pGL3-Promoter、陽(yáng)性對(duì)照pGL3-Control和不同增強(qiáng)子重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。測(cè)量培養(yǎng)48小時(shí)后細(xì)胞裂解液中熒光素酶活性的結(jié)果顯示：當(dāng)增強(qiáng)子片段位于報(bào)告基因啟動(dòng)子上游時(shí)，pGL3-E0和pGL3-E2的熒光素酶活性顯著增高，調(diào)控活性分別是空載體pGL3-Promoter的2.95和3.03倍。當(dāng)增強(qiáng)子連接于報(bào)告基因下游時(shí)，pGL3-E0、pGL3-E1和pGL3-E2的熒光素酶活性與對(duì)照pGL3-Promoter之間的差異具有顯著性，分別是空載體pGL3-Promoter的2.65、2.83和3.13倍。此外，在增強(qiáng)子位于報(bào)告基因不同位置的調(diào)控活性比較中，片段E1位于報(bào)告基因下游時(shí)調(diào)控活性明顯高于其位于報(bào)告基因上游時(shí)的調(diào)控活性。 (五)SPLUNC1基因啟動(dòng)子區(qū)反式作用因子的鑒定 將SPLUNC1基因啟動(dòng)子區(qū)分別含有Snail、YY1、n-MYC和HNF-3beta轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸序列(22～30bp)進(jìn)行3’端生物素標(biāo)記，并退火形成雙鏈的探針，與Glc-82細(xì)胞的核提取物進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)證實(shí)Snail、YY1和n-MYC轉(zhuǎn)錄因子能與Glc-82細(xì)胞核蛋白結(jié)合，形成特異性的DNA-protein復(fù)合物。此外，染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)中，Snail抗體沉淀的DNA模板，可以特異性地?cái)U(kuò)增出SPLUNC1基因啟動(dòng)子區(qū)片段，進(jìn)一步證實(shí)Snail轉(zhuǎn)錄因子參與了SPLUNC1基因的表達(dá)調(diào)控。 結(jié)論： 1．人SPLUNC1基因的表達(dá)具有明顯的細(xì)胞特異性，它可能是一個(gè)與分化有關(guān)的基因，而非鼻咽癌的抑癌基因。 2．SPLUNC1基因5’端側(cè)翼區(qū)-240～+100bp具有啟動(dòng)子活性，并具有一定的細(xì)胞特異性。 3．SPLUNC1基因的-158～-9bp、+3770～+3959bp和+2061～+2201bp序列具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的能力。 4．Snail、YY1和n-MYC轉(zhuǎn)錄因子可能參與了SPLUNC1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R346;R73-3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1520540