發(fā)布時間：2018-02-21 00:57

  本文關鍵詞： SPLUNC1 啟動子 增強子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 表達調(diào)控　出處：《南方醫(yī)科大學》2007年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的常見病、多發(fā)病。從本質(zhì)上來說腫瘤是基因病，其發(fā)生、發(fā)展過程是多種基因表達失常的結果，因此真正意義上的腫瘤治療也應該、同時也必須是以修正這些發(fā)生變化的基因為基點的治療手段。 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方及東南亞地區(qū)常見的一類惡性腫瘤。鼻咽癌的發(fā)生同其他腫瘤一樣，是一個多因素參與和多階段的過程。為了研究鼻咽癌發(fā)病過程中的基因表達變化，何志巍博士通過高密度的cDNA微陣列膜比較了人正常鼻咽和鼻咽癌組織的基因差異表達譜，并從中克隆了一個表達差異具有顯著性的EST全長，命名為YH1基因，GeneBank收錄號為AF158745。 YH1基因定位在染色體20q11.2，基因全長約7.31kb，包括9個外顯子和8個內(nèi)含子；cDNA含有完整的閱讀框架，編碼一個富含亮氨酸(24.6％)、含256個氨基酸的偏酸、疏水性蛋白質(zhì)，有4個磷酸化位點。由于其3'UTR剪切方式不同，存在2種不同的轉(zhuǎn)錄本，但編碼的蛋白質(zhì)相同。YH1基因序列與小鼠的上腭、肺及鼻咽上皮克隆(palate，lung and nasal epithelium clone，PLUNC)基因高度同源，在豬、牛、大鼠等物種中都高度保守，因而被統(tǒng)一歸結為PLUNC家族；因其分子量小，因此人PLUNC基因被命名為SPLUNC1(short plunc 1)。 SPLUNC1基因的表達具有相對的組織特異性。在成人鼻咽組織中有較強的表達，而在鼻咽癌細胞系及活檢組織中表達下調(diào)或不表達；氣管組織中的表達水平明顯高于右心房、空腸、成人肺、唾液腺、胚胎肺組織等。此外，SPLUNC1基因的一個轉(zhuǎn)錄本LUNX在非小細胞性肺癌中表達上調(diào)，而且能在該腫瘤的早期轉(zhuǎn)移淋巴結中檢測到，因而LUNX被認為是一個非小細胞性肺癌淋巴結早期轉(zhuǎn)移的分子標志物。 SPLUNC1基因確切的生物學功能至今仍不明確。生物信息學分析顯示，該基因編碼蛋白的N-端存在一個含19個氨基酸的信號肽，氨基酸序列與腮腺和氣管腺上皮產(chǎn)生的分泌蛋白LCN1和腮腺分泌蛋白(parotid secretary protein)極為相似。對該蛋白三維結構的預測結果顯示內(nèi)部含有一個殺菌／通透性增強蛋白(bactericidal／permeability-increasing protein，BPI)結構域(BPI domain)，其三維折疊結構與BPI折疊極為相似，而BPI的桶狀結構能與細菌細胞壁上脂多糖特異性的結合，從而具有中和內(nèi)毒素及直接殺菌作用，因此推測SPLUNC1蛋白很可能是一種分泌蛋白，并具有結合細菌脂多糖、消滅細菌的功能。此：外，對SPLUNC1基因的單核苷酸多態(tài)性的研究也證實該基因的啟動子區(qū)多態(tài)性與NPC的易感性之間存在著聯(lián)系，是NPC發(fā)生的一個風險因子。 基因表達調(diào)控機制是后基因組時代一個重要的研究內(nèi)容�；�因的正確表達依賴于一個復雜的調(diào)控機制，主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。啟動子是與RNA聚合酶特異結合的DNA序列，是轉(zhuǎn)錄起始所必需的順式元件。在基因表達的調(diào)控中，特定的啟動子起始過程常常決定某個基因是否應當表達。增強子是基因轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控順式作用元件，具有促進啟動子表達下游基因的作用，同其他的負調(diào)控元件和反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子)共同維護著下游基因的正確表達。不同的轉(zhuǎn)錄因子對外界環(huán)境的各種刺激或不同發(fā)育階段的各種信號做出反應，結合于轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，從而控制不同基因的表達。一個基因的正確表達依賴于順式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶三者之間的相互協(xié)同作用。在闡明基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的基礎上，針對性地干預某些轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結合，逆轉(zhuǎn)基因異常表達，產(chǎn)生抗腫瘤效應，已經(jīng)發(fā)展成為腫瘤治療的新方法。 基于人SPLUNC1基因的研究現(xiàn)狀及其在腫瘤發(fā)病機制和防治中的潛在意義，本課題的研究目的是明確人體內(nèi)表達SPLUNC1的細胞類型，鑒定SPLUNC1的啟動子、增強子和有關的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，為深入研究SPLUNC1基因和相關調(diào)控機制、構建組織特異性啟動子及尋找新的治療藥物和作用靶點奠定基礎。本課題進行了如下研究： (一)表達SPLUNC1基因的細胞類型的鑒定 采用原位雜交方法檢測近30種組織中SPLUNC1基因的表達情況，結果顯示SPLUNC1在上腭、表皮、食管及食管—責門部的鱗狀上皮，鼻咽低分化鱗狀細胞癌、食管鱗癌和肺鱗癌的腫瘤細胞，鼻咽部、氣管、宮頸部化生的鱗狀上皮中均不表達；在胃粘膜、膽囊、空腸、結腸、子宮內(nèi)膜及腺體和宮頸部的單層柱狀上皮細胞中也不表達；主要表達在鼻咽、氣管和支氣管的假復層柱狀上皮中，且沿呼吸道從上至下，該基因表達逐漸減弱，在肺組織中檢測不到其表達。在腮腺、下頜下腺的導管和漿液腺細胞、鼻咽、肺和食管等部位的粘膜下漿液腺細胞、胃粘膜下壁細胞及乳腺小葉和導管上皮中也表達SPLUNC1，而粘液腺細胞中不表達。此外，在肺、胃、結腸、乳腺、子宮內(nèi)膜和宮頸等部位的腺癌組織中，SPLUNC1基因均呈強陽性表達。提示SPLUNC1基因很可能是一個與分化有關的基因，，而非鼻咽癌的抑癌基因，其表達具有明顯的細胞特異性。 (二)生物信息學預測SPLUNC1基因表達調(diào)控元件 采用多個生物信息學軟件對SPLUNC1基因5’端-5000bp～+1000bp(以第一外顯子為+1位)序列進行分析，預測SPLUNC1的轉(zhuǎn)錄起始位點位于-1～+10bp區(qū)域間、-29bp處存在TATA box、啟動子位于-490～+89bp區(qū)間；在人和小鼠兩物種間該基因的-245～-1bp區(qū)間高度保守，并且存在多個轉(zhuǎn)錄因子結合位點。這些預測結果為進一步鑒定SPLUNC1基因的調(diào)控元件、探討其表達調(diào)控機制和構建組織特異性啟動子奠定了基礎，具有一定的參考價值。 (三)SPLUNC1基因5’端側翼區(qū)啟動子活性分析 通過Real-time RT-PCR的方法檢測了肺腺癌等十一種細胞系中SPLUNC1基因的表達水平，結果顯示在肺腺癌Glc-82細胞中該基因的表達水平最高，這為進一步研究SPLUNC1基因的調(diào)控機制提供了合適的細胞材料。 在生物信息學預測結果的基礎上，以人基因組DNA為模板，采用PCR方法擴增了5’端截短的P4(-3000～+100bp)、P3(-2000～+100bp)、P2(-1000～+100bp)、P1(-500bp～+100bp)和P0(-240～+100bp)等5個調(diào)控區(qū)片段。預期長度的PCR產(chǎn)物經(jīng)過測序證實后，定向連接至報告基因載體pGL3-Basic的KpnⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)酶切位點上，經(jīng)雙酶切鑒定后，成功構建了5個報告基因重組載體pGL3-P0～pGL3-P4。以pSV-β-Galactosidase質(zhì)粒為內(nèi)對照，將空載體pGL3-Basic、陽性對照pGL3-Control和不同長度調(diào)控區(qū)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Glc-82和293A細胞中，培養(yǎng)48小時后檢測細胞裂解液中熒光素酶活性。結果顯示SPLUNC1基因不同長度調(diào)控區(qū)片段的熒光素酶活性在Glc-82和293A兩種細胞中均存在差異，P0在2種細胞中的轉(zhuǎn)錄活性均高于其他長度的片段；在兩種細胞中，pGL3-P0的熒光素酶活性分別是空載體pGL3-Basic的5.10和2.69倍，說明P0具有啟動子活性，提示SPLUNC1的啟動子可能存在于其5’端序列-240～+100bp區(qū)域中。此外，SPLUNC1基因的5個調(diào)控區(qū)片段在Glc-82細胞中的轉(zhuǎn)錄活性均高于293A細胞，提示SPLUNC1基因的啟動子具有一定的細胞類型特異性。 (四)SPLUNC1基因增強子的鑒定 以人基因組DNA為模板，采用PCR方法對生物信息學預測的5個增強子片段(E0：-158～-9bp；E1：+3770～+3959bp；E2：+2069～+2201bp；E3：+26454～+6555bp；E4：+14553～+14652bp)進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過測序證實后，分別定向連接至報告基因載體pGL3-Promoter中SV40啟動子上游的KpnⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點上和SV40啟動子及報告基因下游的BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位點上，經(jīng)酶切鑒定后，構建了5個報告基因重組載體pGL3-E_(0～4)-up和5個重組載體pGL3-E_(0～4)-down。以pSV-β-Galactosidase質(zhì)粒為內(nèi)對照，將空載體pGL3-Promoter、陽性對照pGL3-Control和不同增強子重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞中。測量培養(yǎng)48小時后細胞裂解液中熒光素酶活性的結果顯示：當增強子片段位于報告基因啟動子上游時，pGL3-E0和pGL3-E2的熒光素酶活性顯著增高，調(diào)控活性分別是空載體pGL3-Promoter的2.95和3.03倍。當增強子連接于報告基因下游時，pGL3-E0、pGL3-E1和pGL3-E2的熒光素酶活性與對照pGL3-Promoter之間的差異具有顯著性，分別是空載體pGL3-Promoter的2.65、2.83和3.13倍。此外，在增強子位于報告基因不同位置的調(diào)控活性比較中，片段E1位于報告基因下游時調(diào)控活性明顯高于其位于報告基因上游時的調(diào)控活性。 (五)SPLUNC1基因啟動子區(qū)反式作用因子的鑒定 將SPLUNC1基因啟動子區(qū)分別含有Snail、YY1、n-MYC和HNF-3beta轉(zhuǎn)錄因子結合位點的寡核苷酸序列(22～30bp)進行3’端生物素標記，并退火形成雙鏈的探針，與Glc-82細胞的核提取物進行結合，通過凝膠遷移阻滯實驗(EMSA)證實Snail、YY1和n-MYC轉(zhuǎn)錄因子能與Glc-82細胞核蛋白結合，形成特異性的DNA-protein復合物。此外，染色質(zhì)免疫沉淀實驗(ChIP)中，Snail抗體沉淀的DNA模板，可以特異性地擴增出SPLUNC1基因啟動子區(qū)片段，進一步證實Snail轉(zhuǎn)錄因子參與了SPLUNC1基因的表達調(diào)控。 結論： 1．人SPLUNC1基因的表達具有明顯的細胞特異性，它可能是一個與分化有關的基因，而非鼻咽癌的抑癌基因。 2．SPLUNC1基因5’端側翼區(qū)-240～+100bp具有啟動子活性，并具有一定的細胞特異性。 3．SPLUNC1基因的-158～-9bp、+3770～+3959bp和+2061～+2201bp序列具有增強轉(zhuǎn)錄的能力。 4．Snail、YY1和n-MYC轉(zhuǎn)錄因子可能參與了SPLUNC1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R346;R73-3

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

1 唐洪新,楊建華,劉麗,李會慶;惡性腫瘤的流行病學和防治對策研究進展[J];邯鄲醫(yī)學高等�？茖W校學報;2000年01期

2 ;Profiling gene expression patterns of nasopharyngeal carcinoma and normal nasopharynx tissues with cDNA microarray[J];Chinese Science Bulletin;2000年09期

3 黎眾魁,謝鷺,何志巍,姚開泰;用cDNA表達陣譜比較鼻咽癌與正常鼻咽組織的基因表達譜差異[J];科學通報;1998年22期

4 何志巍,任彩萍,許亮國,劉衛(wèi)東,謝鷺,黎眾魁,姚開泰;用微陣列研究鼻咽癌與正常鼻咽組織基因表達譜[J];科學通報;1999年23期

5 何志巍,謝鷺,許亮國,藍軻,劉衛(wèi)東,張玲,任彩萍,史建凌,周文,姚開泰;一個與人鼻咽癌相關新基因的克隆[J];科學通報;2000年11期

6 張玲,凌建華,何志巍,姚開泰;用cDNA表達陣譜分析小鼠鼻咽部相對特異表達基因[J];生物化學與生物物理進展;2000年01期

7 呂軍;羅遼復;;人類polⅡ啟動子的識別[J];生物化學與生物物理進展;2005年12期

8 賀智敏,陳主初,邵細云,何春梅,姚開泰;EB病毒對人胚鼻咽上皮細胞的轉(zhuǎn)化[J];中華病理學雜志;1996年01期

9 謝鷺,許亮國,何志巍,周文,王磊,張玲,李贊,姚開泰;用腫瘤cDNA陣列分析鼻咽癌組織的基因表達[J];自然科學進展;2000年04期

本文編號：1520540