發(fā)布時間：2018-02-20 15:29

  本文關(guān)鍵詞： N-甲基-D-天門冬氨酸受體 2B亞基 表位 疫苗 基因 自身抗體 神經(jīng)病理性痛 慢性 痛覺過敏 痛覺異常 鎮(zhèn)痛　出處：《華中科技大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 研究背景與目的 疼痛可使機體對外界傷害性刺激產(chǎn)生防御性反應(yīng),然而,病理性疼痛的治療卻一直是困擾醫(yī)學(xué)的難題,尤其是神經(jīng)病理性疼痛,其發(fā)病機制復(fù)雜、治療困難。阿片類藥物是目前治療神經(jīng)病理痛最常用的鎮(zhèn)痛藥物,但長期用藥會產(chǎn)生阿片耐受與依賴,導(dǎo)致鎮(zhèn)痛失敗。有關(guān)疼痛調(diào)控的受體機制是當(dāng)今神經(jīng)學(xué)科研究領(lǐng)域的熱點,研究表明存在于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors, NMDAR)過度激活能夠產(chǎn)生和釋放致痛活性物質(zhì),在慢性頑固性疼痛的形成、維持過程中起著重要作用[1],本研究室的近期工作亦證實了這一點[2,3]。進一步研究表明,NR2B亞基在疼痛的產(chǎn)生和中樞痛覺過敏的形成中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[4],特異性抑制或阻斷NR2B功能的病理性上調(diào)可以達(dá)到良好的疼痛治療效果,被認(rèn)為是很有希望的新型鎮(zhèn)痛方法。但目前已有的NR2B受體拮抗劑或阻斷劑如CP101606,Ro256981等,由于其心臟毒性至今不能用于臨床[5],對此類特異性藥物繼續(xù)研制將難以突破技術(shù)條件的限制,或?qū)⑾萑搿翱臻g窗”過大或“時間窗”過小的境地,新策略的研究迫在眉睫。 基因免疫(gene immunization)又稱DNA免疫或核酸免疫,是將編碼某種抗原蛋白的外源基因與質(zhì)粒重組后,利用某種方法直接導(dǎo)入動物細(xì)胞內(nèi),使帶有目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到體內(nèi),通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄合成抗原蛋白,經(jīng)內(nèi)源性表達(dá)并提呈給免疫系統(tǒng),誘發(fā)機體產(chǎn)生針對目的抗原蛋白特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫,形成對相應(yīng)病原的免疫保護作用,用于免疫注射的質(zhì)粒DNA稱為核酸疫苗(nucleicaci dvaccine)、基因疫苗(genetic vaccine)或DNA疫苗�，F(xiàn)代疫苗技術(shù)的發(fā)展不僅能夠針對外源性抗原,而且能針對機體自身抗原制備特異性疫苗。表位(epitope)是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團,又稱抗原決定簇(antigenic determinant),它是TCR/BCR及抗體特異結(jié)合的基本單位。表位疫苗(epitope vaccine)是用抗原表位氨基酸序列制備的疫苗,包括合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)、重組表位疫苗(recombinant epitope-based vaccine)及表位核酸疫苗(epitope DNA vaccine,minigenes/epigenes),是目前研制感染性疾病和惡性腫瘤疫苗的方向。鑒定表位常用的方法有:(1)酶解法;(2)用噬菌體顯示肽庫技術(shù)篩選模擬表位;(3)洗脫法:將表位從MHC分子或單抗上洗脫下來,進行測序;(4)合成重疊肽法;(5)用計算機軟件分析整個基因組,將預(yù)測獲得的候選表位肽再用實驗方法驗證,能夠快速準(zhǔn)確的鑒定出抗原表位。本研究擬通過噬菌體肽庫展示技術(shù)篩選NR2B模擬抗原表位,采用基因工程技術(shù)構(gòu)建NR2B表位DNA疫苗,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體,利用該抗體與中樞神經(jīng)系統(tǒng)NR2B高度特異性結(jié)合,成為新型的NR2B特異性“生物拮抗劑”,下調(diào)或阻斷NR2B的激活,從而觀察NR2B表位DNA疫苗的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。旨在建立安全(無致病性)、可靠的鎮(zhèn)痛疫苗庫,為此技術(shù)應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。 研究方法與結(jié)果 1. N-甲基-D-天門冬氨酸受體2B亞基表位的篩選 方法:以NR2B單克隆抗體為配基,免疫親和篩選以融合蛋白形式表達(dá)在絲狀噬菌體M13外殼蛋白Ⅲ上的隨機十二肽。經(jīng)過3輪篩選,從第3輪洗脫物中隨機挑選12個噬菌體克隆擴增后進行ELISA鑒定,用酶標(biāo)儀測定波長450nm處的吸光值。對這12個克隆分別進行擴增、純化,并提取每個克隆的DNA測序以確定插入十二肽的氨基酸序列。通過細(xì)胞競爭ELISA法分析陽性克隆對NR2B天然抗原表位與其單克隆抗體結(jié)合的競爭性抑制。 結(jié)果:經(jīng)過3輪篩選后能與NR2B單抗特異性結(jié)合的噬菌體得到了有效富積。ELISA結(jié)果顯示12個克隆中有9個克隆的A450值顯著高于其它3個克隆。DNA測序結(jié)果分析表明這9個克隆表達(dá)了一個共同序列:5′- TCG CAT CCG CCT GTG ATG CCT TGG CCT ACT TCG ACT-3′,根據(jù)遺傳密碼翻譯得到氨基酸序列為:SHPPVMPWPTST,將其命名為陽性克隆。細(xì)胞競爭性ELISA顯示該陽性克隆可以競爭性抑制細(xì)胞表面天然抗原與特異性抗體的結(jié)合,抑制率(45.2±3.4)%,具有抗原模擬性。 2. N-甲基-D-天門冬氨酸受體2B亞基表位DNA疫苗的構(gòu)建及制備 方法:根據(jù)實驗1所得到的NR2B表位DNA序列,設(shè)計合成兩條部分互補的DNA單鏈,用PCR法合成NR2B表位基因片段。將該NR2B表位編碼基因克隆入真核高效表達(dá)載體pDC515中,構(gòu)建pDC515/eNR2B重組質(zhì)粒,經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切和DNA測序鑒定其正確性。將其在大腸桿菌DH5α中擴增,進行質(zhì)粒大量抽提,DNA純化,得到濃度為600μg/ml的NR2B表位DNA疫苗(pDC515/eNR2B)。在293fectinTM介導(dǎo)下將pDC515/eNR2B體外轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,經(jīng)RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定目的基因的表達(dá)。 結(jié)果:通過基因重組后正確構(gòu)建了pDC515/eNR2B重組質(zhì)粒,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定該片斷大小約80bp,DNA測序證實其序列正確性。經(jīng)過擴增、純化后得到了高純度、高濃度的NR2B表位DNA疫苗。以其轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,在轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中用RT-PCR可檢測到NR2B的mRNA,用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測其胞質(zhì)染色呈陽性。 3. N-甲基-D-天門冬氨酸受體2B亞基表位DNA疫苗免疫學(xué)特性的鑒定 方法:40只SD大鼠隨機分為4組:pDC515/nr 2B組,pDC515組,PBS組及未處理組,每組10只。除未處理組外,其余3組分別用100μg的pDC515/nr 2B、pDC515或100μl的PBS于0 d及7 d各肌注1次進行免疫。于免疫前、二次免疫后8d、14d、21d時,采集大鼠血液分離血清,ELISA法檢測血清中抗NR2B抗體的水平。免疫組織化學(xué)法和Western-blot法檢測免疫血清中NR2B抗體與自身腰段脊髓組織中NR2B受體的特異性結(jié)合。MTT法檢測NR2B表位DNA疫苗免疫大鼠血清對PC12細(xì)胞增殖率的影響。流式細(xì)胞法分析免疫血清對谷氨酸損傷PC12細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響。 結(jié)果:采用肌肉注射法將100μg的NR2B表位DNA疫苗間隔1周免疫大鼠,免疫后8d時大鼠血清中可檢測到特異性NR2B抗體,高滴度持續(xù)至免疫后至少21d。pDC515組、PBS組及未處理組均未檢測到相應(yīng)NR2B抗體。免疫組織化學(xué)法和Western-blot法檢測到NR2B表位DNA疫苗免疫血清中的NR2B抗體可與自身脊髓組織中的NR2B結(jié)合,具有自身抗體的特性。MTT法檢測到NR2B表位DNA疫苗免疫大鼠血清對PC12細(xì)胞增殖率的影響,與pDC515組、PBS組及未處理組血清比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,表明免疫血清中的特異性NR2B抗體對PC12細(xì)胞的生長特性無影響。流式細(xì)胞法分析顯示NR2B表位DNA疫苗免疫大鼠血清可使谷氨酸損傷PC12細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子水平降低,與pDC515組、PBS組及未處理組血清比較,P0.05。 4. N-甲基-D-天門冬氨酸受體2B亞基表位DNA疫苗鎮(zhèn)痛效應(yīng)的研究 方法:80只雄性SD大鼠隨機分為5組:未處理(Naive)組(n=7)、SNI組(n=42)、假手術(shù)(Sham)組(n=7)、SNI+pDC515/eNR2B組(n=12)及SNI+pDC515組(n=12),除Naive組外,SNI組、SNI+pDC515/eNR2B組及SNI+pDC515組3組均實行保留性神經(jīng)損傷術(shù)(spared nerve injury, SNI)建立慢性神經(jīng)病理性疼痛模型,Sham組只對脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)進行游離而不離斷,其余操作同SNI組。其中SNI+pDC515/eNR2B組、SNI+pDC515組分別用100μg的pDC515/eNR2B、pDC515于SNI術(shù)后5 d及12d各肌注1次進行免疫。SNI組(n=42)再隨機分為4個亞組:SNI組(n=8),SNI+Ifen組(n=12),SNI+Morph組(n=12),SNI+mAbNR2B組(n=10)。剔除SNI術(shù)后模型不理想或免疫后體重明顯下降(≥50g)的大鼠,共3只(pDC515/eNR2B組2只,pDC515組1只)。其中SNI+Ifen組和SNI+mAbNR2B組于SNI術(shù)后21d、26d分別腹腔注射10mg/kg的選擇性NR2B拮抗劑Ifenprodil或10mg/kg的NR2B單克隆抗體(mAbNR2B);SNI+Morph組于術(shù)后20 d開始,每次行為學(xué)測試前15min腹腔注射10mg/kg的嗎啡。于SNI術(shù)后-1d、5d、12d、20d、25d、30d、37d用Von Frey絲法測量各組大鼠術(shù)側(cè)后肢機械縮爪閾值( mechanical withdrawal threshold,MWT),以鑒定NR2B表位DNA疫苗(pDC515/eNR2B)的鎮(zhèn)痛效應(yīng),并與mAbNR2B、Ifenprodil、嗎啡的鎮(zhèn)痛效果進行比較。 ELISA法檢測Naive組、SNI組(n=8)、Sham組、SNI+pDC515/eNR2B組及SNI+pDC515組SNI術(shù)后-1d、5d、12d、20d、25d、30d、37d時血清中抗NR2B抗體的水平。SNI術(shù)后37d時處死大鼠,免疫組織化學(xué)染色法計數(shù)各組脊髓背角NR2B陽性細(xì)胞數(shù);免疫組織化學(xué)染色法觀察Naive組、SNI組、Sham組、SNI+pDC515/eNR2B組、SNI+pDC515組、SNI+mAbNR2B組、SNI+Ifen組脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及IL-1β表達(dá)的改變;Western-blot法檢測各組大鼠脊髓組織中NR2B的含量。流式細(xì)胞法檢測NR2B表位DNA疫苗(pDC515/eNR2B)免疫血清、mAbNR2B、Ifenprodil及嗎啡對谷氨酸損傷PC12細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子水平的影響。 結(jié)果:SNI術(shù)后5d大鼠術(shù)側(cè)后爪即出現(xiàn)痛覺異�，F(xiàn)象,與Na?ve組相比,Sham組縮爪閾值的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);其余6組的縮爪閾值明顯降低(均P0.01),并且SNI組、SNI+pDC515組兩組的縮爪閾值持續(xù)降低至處死前,在術(shù)后各時點與Na?ve組比較均有顯著差異(P0.01),表明空質(zhì)粒免疫對慢性痛大鼠的痛敏無改善。SNI術(shù)后12d(即初次免疫后7d但尚未進行二次免疫)時,SNI+pDC515/eNR2B組的縮爪閾值與SNI組相比已明顯升高(P0.05),并持續(xù)至SNI術(shù)后25d、30d、37d,但SNI+pDC515/eNR2B組的縮爪閾值與各時點SNI+Morph組比較仍存在顯著差異(P0.05),而與SNI+mAbNR2B組及SNI+Ifen組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),表明NR2B表位疫苗的鎮(zhèn)痛效果較嗎啡差,但與腹腔直接給與mAbNR2B及Ifenprodil的效果相似。同時結(jié)果還表明,在SNI術(shù)后37d時,SNI+mAbNR2B組及SNI+Ifen組的縮爪閾值與SNI術(shù)后30d時比較又呈下降趨勢,說明腹腔直接給與mAbNR2B及Ifenprodil的鎮(zhèn)痛效果持續(xù)時間較短,停藥后10d左右其作用減弱,而NR2B表位疫苗的鎮(zhèn)痛作用可長時間維持至免疫后3周多。 ELISA法檢測表明肌肉注射NR2B表位DNA疫苗后8天即可有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的特異性抗體,并至少持續(xù)至免疫后3周。 SNI術(shù)后37d(即免疫后25d)時,與Na?ve組相比,SNI組的NR2B陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P0.05); SNI+pDC515/eNR2B組和SNI+mAbNR2B組的NR2B陽性細(xì)胞計數(shù)明顯低于SNI組(P0.05);而SNI+pDC515組、SNI+Ifen組的NR2B陽性細(xì)胞計數(shù)與SNI組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);但SNI+Morph組與SNI組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。表明pDC515/eNR2B免疫及腹腔直接給與mAbNR2B均可下調(diào)被慢性神經(jīng)病理痛激活的NR2B蛋白,而不攜帶NR2B表位的空質(zhì)粒免疫未能下調(diào)激活的NR2B;Ifenprodil作為NR2B的選擇性拮抗劑,雖然同pDC515/eNR2B免疫及腹腔直接給與mAbNR2B一樣可以使慢性神經(jīng)病理痛大鼠的痛閾有所改善,但本研究中未觀察到其對NR2B蛋白表達(dá)的影響。嗎啡雖然顯著逆轉(zhuǎn)了慢性神經(jīng)病理痛大鼠的痛閾,但其對NR2B蛋白的激活卻未見改善。Western-blot法檢測各組大鼠脊髓NR2B含量變化的結(jié)果同免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測結(jié)果。 免疫后25d時,與Na?ve組相比,SNI組脊髓背角的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞明顯激活(P0.05),IL-1β的表達(dá)明顯增加(P0.05);SNI+pDC515/eNR2B組和SNI+ mAbNR2B組的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞仍存在明顯激活(P0.05),與SNI組相比變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),并且SNI+pDC515/eNR2B組和SNI+ mAbNR2B組IL-1β的表達(dá)雖然較SNI組明顯減少(P0.05),但仍較Na?ve組高(P0.05);SNI+pDC515組星形膠質(zhì)細(xì)胞仍處于激活狀態(tài)(P0.05);SNI+Ifen組及SNI+Morph組脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活及IL-1β的高表達(dá)顯著受到抑制,與SNI組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),并且與Na?ve組相比(P0.05),SNI+Ifen組脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活也明顯受到抑制,與SNI組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果提示,pDC515/eNR2B免疫及腹腔直接給與mAbNR2B在脊髓水平作用機制相似,即發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時,可能激活了星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞;而腹腔直接給與嗎啡及Ifenprodil在脊髓水平均可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活,從而pDC515/eNR2B免疫及腹腔直接注射mAbNR2B治療與腹腔直接注射嗎啡及Ifenprodil相比較,在脊髓水平仍存在細(xì)胞因子IL-1β的高表達(dá)。 SNI+pDC515/eNR2B免疫血清、mAbNR2B、Ifenprodil處理均可明顯降低谷氨酸損傷PC12細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子熒光強度(P0.05),而嗎啡處理無此效果。 5.統(tǒng)計學(xué)分析 實驗結(jié)果以±s表示,采用SPSS 12.0軟件,縮爪閾值采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析;其余結(jié)果比較采用單因素方差分析。 研究結(jié)論與總結(jié) 從噬菌體隨機十二肽庫中成功篩選到了能與NR2B特異性抗體結(jié)合的短肽,該肽模擬了天然抗原的某個表位。成功地構(gòu)建和制備了高純度、高濃度的N-甲基-D-天門冬氨酸受體NR2B亞基表位DNA疫苗。NR2B亞基表位DNA疫苗可以誘導(dǎo)SD大鼠產(chǎn)生特異性NR2B抗體,并可持續(xù)一定時間。該疫苗免疫SD大鼠后的免疫血清對PC12細(xì)胞的生長特性無影響,免疫所產(chǎn)生的特異性NR2B抗體可降低谷氨酸損傷引起的胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。通過誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性NR2B抗體,NR2B表位DNA疫苗可以抑制慢性神經(jīng)性病理痛大鼠的痛覺過敏和痛覺異常行為,其鎮(zhèn)痛效果較超常規(guī)劑量(10mg/kg)的嗎啡差,與腹腔給與NR2B的抗體mAbNR2B(10mg/kg)或NR2B的選擇性拮抗劑Ifenprodil(10mg/kg)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)相似,但持續(xù)時間較二者長。NR2B表位DNA疫苗的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與其通過特異性自身抗體下調(diào)腰段脊髓組織中NR2B的高表達(dá)從而降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平有關(guān)。另外,我們雖然觀察到了NR2B表位DNA疫苗免疫及腹腔注射mAbNR2B、Ifenprodil、嗎啡等不同處理對慢性神經(jīng)病理痛大鼠脊髓組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)的改變,但由于只觀察了免疫后25d時的一個時點而未進行動態(tài)監(jiān)測,因此,對基因免疫進行疼痛治療中的免疫機制還需更深入的研究。 本研究通過從噬菌體隨機十二肽庫中篩選N-甲基-D-天門冬氨酸受體2B亞基的模擬表位,利用基因重組技術(shù)合成NR2B表位基因片斷并克隆入真核表達(dá)載體中,從而成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pDC515/eNR2B,并經(jīng)過擴增、純化得到高濃度、高純度的NR2B表位DNA疫苗。采用肌肉注射法免疫SD大鼠后即可獲得滿意的免疫效應(yīng),并可有效地抑制慢性神經(jīng)病理性痛的痛覺過敏和痛覺異常等行為學(xué)改變。同時,通過檢測免疫血清對PC12生長特性的影響及對谷氨酸損傷PC12的保護作用,和脊髓水平神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-1β的變化,對該疫苗的安全性及作用機制進行了初步探討。因此,本研究為基因免疫治療慢性神經(jīng)病理性疼痛的可行性、有效性及安全性做了探索性工作,并得到了初步肯定的結(jié)果,為進一步深入細(xì)致的研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 陳建平;王公明;田學(xué)愎;楊輝;馬國平;田玉科;;pDC515-nr2B重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其免疫效應(yīng)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2007年04期

2 陳建平;田玉科;王公明;楊輝;田學(xué)愎;安珂;;噬菌體展示的肽庫中N-甲基-D-天門冬氨酸受體2B亞基模擬抗原表位的篩選[J];中華麻醉學(xué)雜志;2006年10期

3 安珂;田玉科;楊輝;王賢裕;金小高;高峰;徐穎;田學(xué)愎;王鵬;;鞘內(nèi)移植人前腦啡肽原基因修飾的永生化大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞株對大鼠慢性神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2005年38期

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本文編號：1519308