發(fā)布時間：2018-02-16 12:31

  本文關(guān)鍵詞： SP1 ODNs 轉(zhuǎn)錄因子 α1 3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶 轉(zhuǎn)染 豬內(nèi)皮細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄因子 SP1 ODNs 內(nèi)皮細(xì)胞 異種移植 轉(zhuǎn)錄因子誘騙性寡核苷酸 補(bǔ)體 α1 3-半乳糖殘基 豬內(nèi)皮細(xì)胞 誘騙寡核苷酸 豬內(nèi)皮細(xì)胞 人單個核細(xì)胞 異種移植　出處：《華中科技大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 第一部分Oligofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子SP1反義及誘騙性寡核苷酸轉(zhuǎn)染豬內(nèi)皮細(xì)胞系條件的優(yōu)化研究 【目的】研究擬探索確定高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄因子SP1反義及誘騙性寡核苷酸( AS-ODN及decoy ODNs )在oligofectamine介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系(SV-40-PED)的最佳轉(zhuǎn)染條件和效果,為以轉(zhuǎn)錄因子為靶點的基因治療在抑制異種排斥反應(yīng)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 【方法】針對豬α1,3GT基因上游調(diào)控序列中4個特異啟動子中的啟動子B,設(shè)計并生物合成數(shù)條寡核苷酸分子(AS-ODN、decoy ODNs及錯配ODNs),運(yùn)用oligofectamine轉(zhuǎn)染體系轉(zhuǎn)染永生化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系SV-40-PED。分別應(yīng)用流式細(xì)胞儀和顯微熒光技術(shù),同時測定細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)的含量評價各組PEC的攝取情況以及寡核苷酸分子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對PEC生長的影響情況。 【結(jié)果】SV-40-PED在oligofectamine的介導(dǎo)下可以攝取SP1 AS-ODN及SP1 decoy ODNs。在6孔培養(yǎng)板中,當(dāng)SP1 decoy ODNs終濃度為250nM、轉(zhuǎn)染26 h時,轉(zhuǎn)染效率最佳,其攝取率為(93.37±0.85%),熒光強(qiáng)度為(200.30±12.22);同時細(xì)胞毒性相對較低(乳酸脫氫酶含量為(49.61±17.13)U/L);此時細(xì)胞內(nèi)熒光物質(zhì)主要聚集于細(xì)胞核。而錯配組與陰性對照組相比未見明顯不同。 【結(jié)論】Oligofectamine轉(zhuǎn)染體系是一種高效、低毒的寡核苷酸轉(zhuǎn)染方式。SP1 ODNs終濃度為250 nM、轉(zhuǎn)染26 h時可以為豬內(nèi)皮細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染提供良好效果。本研究為以轉(zhuǎn)錄因子為靶點的基因治療在抑制異種排斥反應(yīng)中的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。 第二部分轉(zhuǎn)錄因子SP1反義及誘騙性寡核苷酸對豬內(nèi)皮細(xì)胞α半乳糖苷鏈表達(dá)的影響 【目的】本研究旨在進(jìn)一步評價SP1 AS-ODN及SP1 decoy ODNs對豬內(nèi)皮細(xì)胞α1,3-GT基因及α-Gal蛋白表達(dá)的影響。 【方法】SP1反義(SP1 AS-ODN)及誘騙性寡核苷酸(SP1 decoy ODNs)轉(zhuǎn)染豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系,細(xì)胞爬片后熒光顯微鏡下觀察α半乳糖糖鏈(αGal)抗原表位的表達(dá);蛋白印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá)情況;流式細(xì)胞學(xué)檢測轉(zhuǎn)染后豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系膜蛋白αGal的表達(dá);RT-PCR法檢測SV-40-PED轉(zhuǎn)染前后α1,3半乳糖轉(zhuǎn)移酶(α1,3GT) m RNA。 【結(jié)果】熒光顯微鏡下細(xì)胞爬片可見轉(zhuǎn)染組(SP1 decoy ODNs組)細(xì)胞膜熒光表達(dá)明顯減弱,部分部位可見點狀熒光缺損。Western blot顯示decoy ODNs /PED的αGal的相對吸光度值為(48.2±0.9),僅為空轉(zhuǎn)染組(只含有轉(zhuǎn)染試劑oligofectamine)(91.6±1.7)的52.6% (P 0 .05)。轉(zhuǎn)染組α1,3GT基因異構(gòu)體的mRNA表達(dá)量(異構(gòu)體1,0.42±0.20;異構(gòu)體2,0.27±0.12)顯著低于空轉(zhuǎn)染組(異構(gòu)體1,0.72±0.17;異構(gòu)體2,0.50±0.19 ;p均 0.05) ,但錯配組(錯義decoy ODNs組)及空轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P 0.05)。 【結(jié)論】SP1 decoy ODNs可以靶向性抑制豬內(nèi)皮細(xì)胞系αGal基因的表達(dá),為抑制超急性排斥反應(yīng)的研究提供了新的思路和策略。 第三部分轉(zhuǎn)染后豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系與抗人血清補(bǔ)體細(xì)胞毒作用的實驗研究 【目的】本研究旨在成功建立對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系SV-40-PED靶向轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上,擬用豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系和人血清建立超急性排斥反應(yīng)(HAR)體外模型,探討TF decoy技術(shù)處理后的豬內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合抗體/補(bǔ)體能力的變化以及是否具有抗人血清補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。 【方法】在抗體/補(bǔ)體與SV-40-PED結(jié)合實驗中,運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測decoy ODNs轉(zhuǎn)染處理SV-40-PED后結(jié)合抗體/補(bǔ)體能力的變化,并通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗評價TF decoy技術(shù)對人血清細(xì)胞毒效應(yīng)的保護(hù)作用。 【結(jié)果】流式細(xì)胞學(xué)檢測中,decoy ODNs組與空轉(zhuǎn)染組相比,無論抗體還是補(bǔ)體結(jié)合水平均有不同程度的下降,抗體/補(bǔ)體下降程度依次為IgM 68.0%,IgG 56.1%,C3c 55.1%(P 0.05)。20%正常人血清(normal human serum, NHS)及40%NHS對空轉(zhuǎn)染組和錯配組SV-40-PED均有不同程度的殺傷能力,而decoy ODNs轉(zhuǎn)染SV-40-PED后即可呈現(xiàn)出對此效應(yīng)的保護(hù)作用,與空轉(zhuǎn)染組相比,20%NHS組和40%NHS組其靶細(xì)胞溶解率分別下降15.0%和30.2% (P0.05),表現(xiàn)為補(bǔ)體對SV-40-PED的殺傷率不同程度的下降�？辙D(zhuǎn)染組和錯配組間殺傷率無明顯差異(P0.05),熱滅活正常人血清(heat-inactivated NHS, HINHS)作為陰性對照對各組SV-40-PED均表現(xiàn)出背景毒性作用。 【結(jié)論】在體外補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)中,decoy ODNs轉(zhuǎn)染豬內(nèi)皮細(xì)胞SV-40-PED可以呈現(xiàn)出其保護(hù)作用。 第四部分轉(zhuǎn)染后豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系與人外周血單個核細(xì)胞之間的作用研究 【目的】建立人外周血單個核細(xì)胞和豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)研究模型,在體外模擬異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞與人血清相互作用的過程,探討decoy ODNs在人PBMC對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞單向混合培養(yǎng)實驗中的影響。 【方法】SV-40-PED轉(zhuǎn)染后分別運(yùn)用氚3-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)法和MTT法檢測人外周血單個核細(xì)胞和豬血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型中人PBMC的增殖情況,探討人外周血單個核細(xì)胞與轉(zhuǎn)染前后豬內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的變化。 【結(jié)果】未加入刺激細(xì)胞的人外周血單個核細(xì)胞增生微弱,加入經(jīng)絲裂霉素C處理的異種刺激細(xì)胞SV-40-PED后,各組人外周血單個核細(xì)胞均分裂增生,并在5～7d左右逐漸達(dá)到最大。在共培養(yǎng)第5天,3H-TdR法檢測顯示decoy ODNs轉(zhuǎn)染組的cpm值的下降程度為空轉(zhuǎn)染組的67.1%,空轉(zhuǎn)染組和錯配組的組間比較無明顯差異(P 0.05)。decoy ODNs轉(zhuǎn)染處理SV-40-PED后第5天,MTT法顯示人PBMC的增殖能力僅為空轉(zhuǎn)染組的39.2% (P 0.05),呈現(xiàn)出對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。 【結(jié)論】在人外周血單個核細(xì)胞和豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)研究模型中,decoy ODNs轉(zhuǎn)染處理SV-40-PED可以部分抑制人PBMC的增殖。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R617;R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙中辛,杜競輝,姜漢英,夏穗生;異種移植超急性排斥機(jī)理的實驗研究[J];中華器官移植雜志;1996年01期

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本文編號：1515526