發(fā)布時(shí)間：2018-02-16 03:11

  本文關(guān)鍵詞： hCGβ 人分子佐劑hC3d 免疫避孕 抗hCGβ避孕疫苗 協(xié)同刺激分子 免疫效應(yīng)　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2006年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的從人肝cDNA文庫(kù)克隆C3基因片段hC3d，將三個(gè)拷貝的hC3d與hCGβ基因融合，構(gòu)建攜分子佐劑的hCGβ-hC3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒，體外獲得穩(wěn)定高效表達(dá)細(xì)胞株，并獲得較高純度的目的蛋白hCGβ-hC3d3和hCGβ。目的蛋白體外作用于人外周血免疫細(xì)胞，以了解融合蛋白hCGβ-hC3d3的免疫原性及免疫效應(yīng)，探討分子佐劑hC3d的作用機(jī)制，為重組hCGβ-hC3d3融合蛋白疫苗最終用于人類(lèi)奠定基礎(chǔ)。 方法以人肝cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增hC3d基因片段，插入pMD18-T simple載體，構(gòu)建含三個(gè)拷貝hC3d的pMD18-T-hC3d3質(zhì)粒；以phCMV1-6his-hCGβ為模板擴(kuò)增帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的hCGβ基因片段，將其構(gòu)建入高效真核表達(dá)載體pCI-gs得到pCI-gs-signal-6His-hCGβ真核表達(dá)質(zhì)粒。將hCGβ基因片段插入pMD18-T-hC3d3質(zhì)粒，使hCGB與hC3d3基因融合，再構(gòu)建入pCI-gs獲得pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3真核表達(dá)質(zhì)粒。脂質(zhì)體法介導(dǎo)重組質(zhì)粒pCI-gs-signal-6His-hCGβ、pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，序列濃度MSX篩選抗性細(xì)胞克��；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗性克隆培養(yǎng)上清hCGβ含量，以選擇高效表達(dá)克隆。Western blotting鑒定目的蛋白；Raji細(xì)胞免疫化學(xué)染色法鑒定hCGβ-hC3d3融合蛋白。采用針對(duì)6His的鎳柱結(jié)合凝膠過(guò)濾層析純化表達(dá)產(chǎn)物。 用L-亮氨酸甲基酯(L-LME)或B細(xì)胞磁珠陰性分離試劑盒對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行細(xì)胞分離純化；實(shí)驗(yàn)分四組：B細(xì)胞、B+T細(xì)胞組、PBMC和Raji細(xì)胞組。分別應(yīng)用1nM、10nM、100nM不同濃度的hCGβ、hCGβ-hC3d3及美洲商陸(PWM)等抗原體外作用于以上細(xì)胞10-12d，用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中總免疫球蛋白(Ig)及抗hCGβ抗體的分泌水平；用氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(~3H-TdR)摻入法了解不同抗原刺激后各組細(xì)胞增殖情況，而ELISPOT可測(cè)定各種抗原刺激后Ig或特異抗體的分泌細(xì)胞數(shù)量。另外，為探討分子佐劑hC3d3的作用機(jī)制，用100nM的hCGβ、hCGβ-hC3d3或PWM等抗原與B細(xì)胞、B+T細(xì)胞、PBMC細(xì)胞體外作用48h，用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-2濃度；用熒光抗體標(biāo)記培養(yǎng)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)B細(xì)胞、T細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子CD80、CD86、CD154的表達(dá)情況及Th細(xì)胞活化后IL-2Rα鏈(CD25)的表達(dá)水平。 結(jié)果分子克隆的hC3d基因片段的測(cè)序結(jié)果與目的基因一致。酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果顯示，pMD18-T-hC3d3、pCI-gs-signal-6His-hCGβ、pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，經(jīng)抗性克隆篩選，各挑選出一個(gè)高表達(dá)細(xì)胞株，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其培養(yǎng)上清中hCGβ的含量結(jié)果顯示，pCI-gs表達(dá)效率明顯高于pcDNA和phCMV1。Western blotting分析顯示，pCI-gs-signal-6His-hCGβ的表達(dá)產(chǎn)物為24KDa；而pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3的表達(dá)產(chǎn)物有三種，大小分別為136 KDa、100 KDa、64 KDa。鎳柱結(jié)合分子篩純化可獲得較高純度的融合蛋白hCGβ-hC3d3和hCGβ。 用不同濃度hCGβ、hCGβ-hC3d3及PWM作用于B細(xì)胞、B+T細(xì)胞、PBMC、Raji細(xì)胞10～12d后，~3H-TdR摻入法分析顯示：與hCGβ處理組相比，融合蛋白hCGβ-hC3d3能使各組細(xì)胞增殖明顯升高，且呈濃度依賴(lài)性�？侷g水平檢測(cè)結(jié)果表明，100nM hCGβ-hC3d3與前三組細(xì)胞共培養(yǎng)上清中總Ig的含量分別為hCG B刺激組的4倍、10倍和10.85倍；且呈濃度依賴(lài)性。ELISPOT結(jié)果與上清檢測(cè)結(jié)果類(lèi)似，經(jīng)與hCGβ-hC3d3共培養(yǎng)后Ig生成細(xì)胞較hCGβ組明顯增加。用100nM的不同抗原共培養(yǎng)12d后，取培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明，經(jīng)hCGβ及PWM刺激后，上清中均未檢測(cè)到抗hCGβ特異性抗體；與hCGβ-hC3d3培養(yǎng)后則在B+T細(xì)胞、PBMC組可見(jiàn)低水平抗hCGβ抗體。用ELISPOT法分析抗hCGβ特異性抗體生成細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hCGβ刺激的細(xì)胞僅有數(shù)個(gè)散在的陽(yáng)性細(xì)胞；而經(jīng)hCGβ-hC3d3刺激后，陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多(P＜0.05)。 流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果提示：與hCGβ比較，hCGβ-hC3d3蛋白能顯著上調(diào)B細(xì)胞表面CD80、CD86分子的表達(dá)，尤其是CD86分子的表達(dá)；能明顯增強(qiáng)T細(xì)胞表面CD154、CD25分子的表達(dá)(P＜0.05)。hCGβ-hC3d3蛋白能提高B細(xì)胞抗原提呈的能力及T細(xì)胞活化后分泌IL-2的能力(P＜0.05)。 結(jié)論成功克隆了人hC3d基因片段，實(shí)現(xiàn)了hC3d3與hCGβ的基因融合；構(gòu)建了pCI-gs-signal-6His-hCGβ，pCI-signal-6His-hCGβ-hC3d3真核表達(dá)質(zhì)粒；并在CHO細(xì)胞中獲得hCGβ蛋白、hCGβ-hC3d3融合蛋白的高效分泌性穩(wěn)定表達(dá)。鎳柱結(jié)合分子篩可獲得較高純度的目的蛋白。hCGβ-hC3d3可通過(guò)提高人外周血B細(xì)胞及T細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子的表達(dá)，促進(jìn)B細(xì)胞活化，，改善其抗原提呈能力，加強(qiáng)B細(xì)胞T細(xì)胞間相互作用，有效活化T輔助細(xì)胞；分子佐劑hC3d能增強(qiáng)人外周免疫活性細(xì)胞對(duì)hCGβ抗原的反應(yīng)性，顯著提高B細(xì)胞合成Ig及特異性抗體的能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1514526