發(fā)布時間：2018-02-14 06:58

  本文關(guān)鍵詞： 桿狀病毒 哺乳動物細胞 基因轉(zhuǎn)移載體 人乳頭瘤病毒 病毒滴度　出處：《廈門大學》2006年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： HPV感染是常見的性傳播疾病,與宮頸癌及泌尿生殖道相關(guān)癌癥的發(fā)生關(guān)系密切,嚴重危害人類健康。開發(fā)安全有效的HPV預防疫苗有望消滅或顯著降低HPV感染造成的危害,具有十分重大的社會意義。我實驗室正在研究開發(fā)HPV基因工程疫苗,迫切需要可簡便有效對候選疫苗的保護性進行評估的方法。目前的HPV體外感染模型在實驗周期、穩(wěn)定性、滴度等方面存在各自的缺點,而新型實驗技術(shù)平臺的發(fā)展為構(gòu)建更有效的感染模型提供了有利條件。桿狀病毒近幾年來被發(fā)現(xiàn)可作為一種對哺乳動物細胞的新型基因轉(zhuǎn)移載體,相比其它基因轉(zhuǎn)移方法具有許多獨特的優(yōu)勢。本論文即探討了應用重組桿狀病毒在哺乳動物細胞中構(gòu)建HPV假病毒的可行性。為了更有效的獲得HPV假病毒本論文對重組桿狀病毒對哺乳動物細胞的基因轉(zhuǎn)移方法進行了研究,建立了更為簡便、快捷且高效的基因轉(zhuǎn)移方法。該方法被成功用于建立了有效的HPV16假病毒體外感染模型,以及鑒定桿狀病毒滴度的新方法。 本研究利用Bac-to-Bac系統(tǒng)、增強型綠色熒光蛋白EGFP和CMV-T7聯(lián)合啟動子構(gòu)建對哺乳動物細胞的桿狀病毒基因轉(zhuǎn)移載體,首先探討了直接使用重組桿狀病毒感染后的昆蟲細胞培養(yǎng)上清對哺乳動物細胞進行基因轉(zhuǎn)移的可行性。將重組桿狀病毒感染4d后的Sf-9細胞培養(yǎng)上清(≥1.0×10~7PFU/mL)直接與HepG2細胞37℃作用12h,可獲得高于95%的基因轉(zhuǎn)移效率,證明了重組桿狀病毒感染后的昆蟲細胞培養(yǎng)上清可直接用于高效轉(zhuǎn)導哺乳動物細胞。通過對轉(zhuǎn)導時間和稀釋比例的優(yōu)化,顯示用哺乳動物細胞培養(yǎng)基等體積稀釋后的帶毒上清可兼具高效和低損傷的特點。應用上述結(jié)果本研究首次提出并初步建立了重組桿狀病毒上清轉(zhuǎn)導法。該方法與脂質(zhì)體、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組痘苗病毒進行的對比顯示其具有高效、低毒的優(yōu)點。應用該方法對27種不同類型及組織來源的哺乳動物細胞進行基因轉(zhuǎn)移實驗,包括16種人類組織細胞、9種嚙齒類組織細胞和2種猴組織細胞,結(jié)果顯示該方法具有較好的適用性,可有效轉(zhuǎn)導大多數(shù)哺乳動物細胞。并發(fā)現(xiàn)重組桿狀病毒對靈長類來源細胞的基因轉(zhuǎn)移效率顯著高于對嚙齒類來源細胞,對貼壁細胞的基因轉(zhuǎn)移效率顯著高于對懸浮細胞。 結(jié)合最新的研究進展,本研究進一步對病毒上清轉(zhuǎn)導法的實驗條件進行摸索優(yōu)化,并嘗試采用新方法提高轉(zhuǎn)導效率。對使用不同的稀釋緩沖液和轉(zhuǎn)導溫度的研究結(jié)果顯示,以PBS作為稀釋緩沖液在27℃下進行轉(zhuǎn)導可顯著提高轉(zhuǎn)導效率。在PBS環(huán)境中對比不同轉(zhuǎn)導時間和稀釋比例以及不同血清含量對轉(zhuǎn)導效果的影響結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)導效率與轉(zhuǎn)導時間和病毒用量均呈正相關(guān),并首次發(fā)現(xiàn)PBS中存在血清成分不利于提高轉(zhuǎn)導效率。應用不同濃度丁酸鈉增強表達的實驗結(jié)果顯示,0.5～1mM的丁酸鈉較為合適于在CV1細胞中提高桿狀病毒載體的表達效率,更高濃度的丁酸鈉對細胞有明顯毒性。本研究首次在桿狀病毒轉(zhuǎn)導哺乳動物細胞中使用離心方法,結(jié)果顯示通過600g水平離心1h即可獲得高水平的轉(zhuǎn)導和表達效率,優(yōu)于在PBS環(huán)境中27℃孵育8h的效果,并進一步對離心時間、離心后孵育時間、緩沖液進行了摸索優(yōu)化。 應用上述結(jié)果本研究首次提出并建立了重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導法。病毒上清以PBS為緩沖環(huán)境600g水平離心1h進行轉(zhuǎn)導的方法可在獲得高轉(zhuǎn)導效率的同時顯著縮短實驗時間,提高了實驗效率。該方法具有簡便、快捷和高效的特點,并可作為一種常規(guī)操作方法用于日常實驗。本研究同時探討了輔助感染可表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒VV-T7RP對表達的影響,顯示輔助感染VV-T7RP可顯著增強帶有CMV-T7聯(lián)合啟動子的重組桿狀病毒的表達效果,表明將重組痘苗病毒VV-T7RP與重組桿狀病毒結(jié)合可建立一種高效瞬時表達方法。 本研究首次設(shè)計構(gòu)建了可同時在哺乳動物細胞中表達HPV16L1和L2蛋白的重組桿狀病毒,并采用本研究建立的重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導法,探討了通過重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導方法在哺乳動物細胞中表達組裝HPV16假病毒的可行性。細胞感染實驗和透射電鏡觀察結(jié)果證實,通過該方法成功獲得了具有感染能力的HPV16假病毒。應用已被證實的4株HPV16單抗,證明該假病毒感染模型可應用于進行中和實驗。應用該模型,從本實驗室構(gòu)建的18株HPV16單抗中篩選獲得2株中和單抗3D10和PD1,同時證明本實驗室構(gòu)建的候選基因工程疫苗HPV16 VLP可激發(fā)Balb/c小鼠產(chǎn)生具有中和能力的保護性體液免疫。該模型的成功建立為HPV16中和抗體的篩選和HPV16預防疫苗的研究提供了必要的條件和有力的支持,也為進一步構(gòu)建其它型別的HPV假病毒體外感染模型提供了基礎(chǔ)。本研究還首次嘗試了使用HPV16假病毒對昆蟲細胞的感染實驗,顯示HPV16假病毒可能具有將核酸導入昆蟲細胞的能力。 大量的關(guān)于重組桿狀病毒表達系統(tǒng)的應用研究實踐顯示,準確測定病毒滴度對于保持蛋白生產(chǎn)和研究實驗的穩(wěn)定性是十分重要的。本研究綜合了應用重組桿狀病毒上清離心轉(zhuǎn)導法可高效轉(zhuǎn)導哺乳動物細胞的特點以及輔助感染VV-T7RP可顯著增強CMV-T7聯(lián)合啟動子表達水平的特點,提出了新型的可在哺乳動物細胞中測定重組桿狀病毒滴度的方法。本研究設(shè)計構(gòu)建了同時具有在昆蟲細胞中和哺乳動物細胞中高效表達報告基因的重組桿狀病毒。應用該病毒首先在昆蟲細胞中準確測定滴度,再通過梯度稀釋后離心轉(zhuǎn)導CV1細胞并輔助感染VV-T7RP,在12～24h后直接觀察細胞發(fā)光情況,以TCID_(50)方法計算病毒滴度。結(jié)果顯示,以CMV-T7聯(lián)合啟動子引導的EGFP報告基因表達元件在VV-T7RP輔助下具有最高的檢測靈敏度,其測得的滴度與昆蟲細胞中測得的滴度相當,優(yōu)于單獨使用CMV啟動子或T7啟動子。本研究首次提出了可將CMV-T7-EGFP表達元件作為一種優(yōu)良的病毒滴度鑒定元件克隆于桿狀病毒載體上,其在昆蟲細胞中不會進行有效表達和干擾重組蛋白和病毒的生產(chǎn),同時又可在哺乳動物細胞中進行高靈敏度和快速、直觀的檢測,不需要使用流式細胞儀進行分析。該方法為重組桿狀病毒滴度的測定提供了一種選擇。
[Abstract]:HPV infection is a common sexually transmitted disease , which is closely related to the occurrence of cervical cancer and related cancers of the urinary tract . It is of great social significance to develop a safe and effective HPV vaccine to prevent or significantly reduce the risk of HPV infection . In this study , the gene transfer efficiency of recombinant baculovirus was investigated . The results showed that the gene transfer efficiency of recombinant baculovirus was higher than that in HepG2 cells . In this study , the effect of different signal transduction time and dilution ratio and different serum levels on the transduction efficiency was studied . The results showed that the transfection efficiency was positively correlated with the time of transduction and the dosage of virus . The results showed that the transfection efficiency was better than that in PBS . The results showed that 0.5 锝，

本文編號：1510132