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  本文關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞肝癌CT動(dòng)脈期強(qiáng)化特點(diǎn)與腫瘤病理分化關(guān)系的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《汕頭大學(xué)》 2011年

靶向VEGF基因的microRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其功能鑒定

郝濤  

【摘要】：目的： 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一種重要的促血管生成因子，它可以通過(guò)自分泌的形式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自身的生長(zhǎng)，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等諸多方面均起著至關(guān)重要的作用。如何有效的抑制VEGF基因的表達(dá)已經(jīng)成為治療腫瘤的關(guān)鍵所在。MicroRNA（miRNA）是一種廣泛存在的非編碼小RNA，通過(guò)與其靶基因3’UTR中的靶序列互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，在翻譯水平負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)，具有抑癌基因和癌基因的功能，補(bǔ)充并豐富了腫瘤的發(fā)生機(jī)制。最近大量的研究提示，通過(guò)借助miRNA的表達(dá)框架，可以將靶向特定基因的人工合成的外源性miRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)抑制目的靶基因的效果。因此，本實(shí)驗(yàn)研究構(gòu)建了靶向VEGF基因的外源性MicroRNA表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，觀察外源性MicroRNA介導(dǎo)的RNA干擾能否阻斷VEGF基因的表達(dá)，通過(guò)測(cè)定靶基因的抑制程度和VEGF蛋白的降低程度，并從中挑選出抑制效果最佳的序列，從而了解靶向VEGF基因的外源性MicroRNA的表達(dá)對(duì)VEGF基因表達(dá)的影響。 方法 (1)序列設(shè)計(jì)合成：從GenBank上搜索獲得VEGF基因（Genebank ID：NM_001025366）的mRNA序列，應(yīng)用Invitrogen公司提供的在線軟件，設(shè)計(jì)4對(duì)針對(duì)VEGF基因的pre-microRNA寡核苷酸序列，并得到其互補(bǔ)序列，經(jīng)NCBI Blast排除其非特異同源性。同樣設(shè)計(jì)一段陰性對(duì)照序列（Neg），該陰性對(duì)照不針對(duì)人體任何mRNA序列。 (2)真核載體構(gòu)建：合成上述設(shè)計(jì)好的序列，分別構(gòu)建入pcDNA6. 2-GW / EmGFP miR真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)大腸桿菌。對(duì)經(jīng)過(guò)初步鑒定的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒并純化、測(cè)序。重組體分別命名為VEGF-miRNA-1，VEGF-miRNA-2，VEGF-miRNA-3，VEGF-miRNA-4，VEGF-miRNA- Neg。 (3)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將上述四組重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至四組人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞中，空白對(duì)照為單純加Lipofectamine 2000。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞EmGFP的表達(dá)，以評(píng)估質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。 (4)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果：qPCR、Western-blot測(cè)定不同組之間肝癌細(xì)胞VEGF mRNA及VEGF蛋白的表達(dá)量的差異，從而驗(yàn)證miRNA-VEGF對(duì)靶基因的特異性抑制作用，并明確抑制作用最強(qiáng)的重組質(zhì)粒及其所攜帶的miRNA序列。 結(jié)果 (1)成功構(gòu)建了針對(duì)VEGFmRNA序列的4條MicroRNA真核表達(dá)載體； (2)干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞后，定量PCR檢測(cè)顯示，VEGF-miRNA-1、VEGF-miRNA-2、VEGF-miRNA-3、VEGF-miRNA-4干擾質(zhì)粒對(duì)靶基因mRNA表達(dá)都有抑制作用，其中VEGF-miRNA-3干擾質(zhì)粒抑制作用最顯，抑制率達(dá)87%，與空白對(duì)照組相比，具有明顯差異(P0.05)；Western-blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)水平顯示，VEGF-miRNA-1、VEGF-miRNA-2、VEGF-miRNA-3干擾質(zhì)粒對(duì)靶基因蛋白表達(dá)有抑制作用，其中VEGF-miRNA-3干擾質(zhì)粒抑制作用最明顯，抑制率達(dá)87%，與空白對(duì)照組相比，具有明顯差異(P0.05)。 結(jié)論 成功構(gòu)建了靶向VEGF基因的MicroRNA真核表達(dá)載體，該表達(dá)載體可顯著抑制HepG-2細(xì)胞中的VEGF基因的表達(dá)，為下一步肝癌的基因治療提供了理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

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本文編號(hào)：127448