發(fā)布時(shí)間：2024-04-22 05:59

　　目的建立漢灘病毒(Hantaan virus, HTNV)微基因組系統(tǒng),并進(jìn)行初步評價(jià)。方法用分子克隆方法構(gòu)建HTNV微基因組系統(tǒng)所需的微基因組質(zhì)粒和表達(dá)核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, NP)、RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)的輔助質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞;并在輔助病毒添加與否的情況下進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果成功構(gòu)建了基于HTNV L片段非編碼區(qū)的綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)和Gaussia熒光素酶(gaussia luciferase, Gluc)的微基因組質(zhì)粒,GFP微基因組在輔助病毒HTNV感染的情況下可觀察到明顯綠色熒光,Gluc微基因組在輔助病毒感染或者輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染情況下均可檢測到Gluc的表達(dá)。結(jié)論成功建立了HTNV的微基因組系統(tǒng),為研究HTNV的復(fù)制機(jī)理和抗病毒藥物的篩選提供了重要工具。

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【部分圖文】：

圖2輔助質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

圖1微基因組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定2.2GFP微基因組系統(tǒng)的活性評價(jià)

圖4Gluc微基因組系統(tǒng)的活性評價(jià)

圖3GFP微基因組質(zhì)粒的活性鑒定(×200)3討論

圖1微基因組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

輔助質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定:①通過亞克隆獲得NP哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒pCAG-NP,并經(jīng)EcoRI和KpnI雙酶切鑒定可觀察到大小約1.3kb目的條帶,見圖2A;②分片段全基因合成的pUC-L1、pUC-L2和pUC-L3經(jīng)KpnI和SalI雙酶切后獲得相應(yīng)大小的目的條帶,見圖2B....

圖3GFP微基因組質(zhì)粒的活性鑒定(×200)

在細(xì)胞培養(yǎng)上清中,與單轉(zhuǎn)質(zhì)粒組相比,感染HTNV可明顯提高Gluc水平,但三轉(zhuǎn)質(zhì)粒組僅有較低水平的升高;三轉(zhuǎn)質(zhì)粒并感染HTNV組與三轉(zhuǎn)質(zhì)粒組的Gluc水平相差不大。因?yàn)镚luc具有信號肽,表達(dá)產(chǎn)物主要分泌至細(xì)胞上清,所以在細(xì)胞裂解液中Gluc水平相差不大,見圖4。圖4Gluc微....

本文編號：3962028