發(fā)布時(shí)間：2020-12-04 10:21

　　一.研究目的：研究Smad相互作用蛋白-1（Sipl/Zfhx1b）對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的調(diào)節(jié)作用,以及發(fā)現(xiàn)Sip1的直接作用的下游基因,并探索Sip1/Zfhx1b促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟和啟動(dòng)髓鞘生成作用的分子機(jī)制。二.研究方法：1.Sip1/Zfhx1b在少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟中的作用：（1）免疫染色法測(cè)定Sip1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞豐富區(qū)域的表達(dá)情況；（2）原位雜交技術(shù)確定Sip1在脊髓中的發(fā)育情況；（3）建立少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Sip1特異性敲除模型,評(píng)價(jià)Sip1敲除后小鼠的小鼠表型和生存的影響；（4）Sip1敲除小鼠模型中,免疫染色法和原位雜交技術(shù)評(píng)價(jià)與少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的相關(guān)標(biāo)記物的變化情況；（5）電鏡下觀察Sip1敲除小鼠的髓鞘生成的變化情況；（6）免疫染色法評(píng)價(jià)體外敲除Sip1基因?qū)ι偻荒z質(zhì)細(xì)胞的影響；（7）Sip1敲除小鼠模型中,原位雜交技術(shù)確定OPC的增殖能力的改變情況。2. Sipl/Zfhx1b調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟和啟動(dòng)髓鞘生成作用的分子機(jī)制研究：2.1 Sipl/Zfhx1b調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟相關(guān)通路的分子機(jī)制研究（1）熒光素酶報(bào)告基因法確定S... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：100 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
目次
前言
第一部分 Sip1基因條件下敲除后的表型研究
    1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        1.1.1 儀器
        1.1.2 藥物與試劑
        1.1.3 細(xì)胞株和OPC原代培養(yǎng)
        1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 Sip1條件性敲除小鼠和Olig1突變型小鼠模型構(gòu)建
        1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.2.1 pCIG-HA-Smad7,pCIG-Flag-Smurf1,pCIG-mSIP1構(gòu)建
            1.2.2.2 lenti-GFP-HA-Smad7,lenti-GFP-mSip1,lenti-GFP—Flag-Smurf1構(gòu)建
        1.2.3 OPC的純化和分化
        1.2.4 組織學(xué)和原位雜交
        1.2.5 組織和細(xì)胞免疫熒光和confocal顯微鏡
        1.2.6 病毒制備
            1.2.6.1 腺病毒制備
            1.2.6.2 慢病毒制備
    1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1.3.1 Sip1/Zfhx1b在Olig1突變小鼠中顯著下降
        1.3.2 Sip1表達(dá)在腦組織和脊髓少突膠質(zhì)細(xì)胞豐富的區(qū)域
        1.3.3 Sip1在脊髓腹側(cè)的發(fā)育情況
        1.3.4 Sip1敲除引起動(dòng)物的死亡
        1.3.5 Sip1敲除能抑制髓鞘基因生成和軸突髓鞘化
        1.3.6 OPC生成和增殖不受Sip1敲除的影響
        1.3.7 體外敲除Sip1抑制OPC的分化
第二部分Sip1調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和啟動(dòng)軸突髓鞘化的作用機(jī)制研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.2 藥物與試劑
        2.1.3 細(xì)胞株和OPC原代培養(yǎng)
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 Sip1條件性敲除小鼠模型構(gòu)建
        2.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.2.1 pCIG-HA-Smad7,pCIG-Flag-Smurf1,pCIG-mSIP1構(gòu)建
            2.2.2.2 lenti-GFP-HA-Smad7,GFP-mSip1,GFP—Flag-Smurf1構(gòu)建
        2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.4 OPC的純化和分化
        2.2.5 組織學(xué)和原位雜交
        2.2.6 組織和細(xì)胞免疫熒光和confocal顯微鏡
        2.2.7 western blotting和免疫共沉淀
            2.2.7.1 western blotting
            2.2.7.2 免疫共沉淀
        2.2.8 病毒制備
            2.2.8.1 腺病毒制備
            2.2.8.2 慢病毒制備
        2.2.9 熒光素酶報(bào)告基因法
        2.2.10 染色質(zhì)免疫共沉淀
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 Sip1拮抗Smad/BMP信號(hào)通路在少突膠質(zhì)細(xì)胞分化過程中的抑制性作用
            2.3.1.1 Sip1拮抗磷酸化Smad1在少突膠質(zhì)細(xì)胞分化過程中的抑制性作用
            2.3.1.2 Sip1拮抗Id2、4和Hes1的激活
            2.3.1.3 Sip1的敲除不改變pSmad1的表達(dá)
            2.3.1.4 OLs階段pSmad1連接Sip1和p300形成復(fù)合物
        2.3.2 Sip1通過影響不同的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子促進(jìn)OPC的分化
        2.3.3 Sip1調(diào)控的髓鞘基因和BMP等相關(guān)通路
        2.3.4 Sip1調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)因子的啟動(dòng)子區(qū)域
        2.3.5 Smad7是少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Sip1的下游基因
            2.3.5.1 Smad7表達(dá)在野生型小鼠脊髓腹側(cè)部的少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)
            2.3.5.2 Sip1和Smad7在OLs內(nèi)表達(dá)明顯增多
            2.3.5.3 Sip1直接調(diào)控Smad7的表達(dá)
            2.3.5.4 Smad7過表達(dá)拮抗Sip1基因缺失引起的OPC分化障礙
        2.3.6 Smad7協(xié)同Smurf1調(diào)控BMP和Wnt信號(hào)通路
        2.3.7 Smad7促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物的異位表達(dá)
        2.3.8 Smad7敲除能抑制髓鞘基因生成
3 討論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介及在讀期間所取得的科研成果



本文編號(hào)：2897428