發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 08:29

【摘要】：腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是重癥或致死性手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原體,能夠入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS),造成永久性的損傷。目前,臨床上的主要治療方法為對(duì)癥治療及靜脈注射免疫球蛋白,尚無針對(duì)EV71感染可用的抗病毒藥物。因此,開發(fā)安全有效的EV71的抗病毒藥物具有重要意義。Retro-2~(cycl)是通過細(xì)胞高通量篩選(High-throughput screening,HTS)的方法得到的蛋白毒素抑制劑,對(duì)多種病原體的抑制活性相繼被報(bào)道。Retro-2~(cycl)通過靶向阻斷細(xì)胞囊泡運(yùn)輸(Intracellular vesicle transport)而對(duì)利用這一過程的病原體發(fā)揮抑制作用。細(xì)胞囊泡運(yùn)輸參與了EV71生命周期中包括非裂解性釋放(Non-lytic release)的數(shù)個(gè)重要過程,為Retro-2~(cycl)以及其活性衍生物Retro-2.1作為EV71潛在的抗病毒藥物的研究提供了可行性。因此,本論文對(duì)Retro-2~(cycl)及Retro-2.1對(duì)EV71的抗病毒作用進(jìn)行了研究。黃酮類化合物(Flavonoids)是一類具有相同母核的小分子化合物,有多種生物活性。其中,數(shù)種黃酮類化合物對(duì)EV71的抗病毒活性已經(jīng)被相繼報(bào)道。然而,這些報(bào)道來自于不同研究體系,限制了化合物間橫向比較的可能性;此外,這些報(bào)道僅限于細(xì)胞水平的研究,而動(dòng)物模型的有效性是驗(yàn)證藥物發(fā)展?jié)摿Φ闹匾�指�?biāo)。因此,本論文對(duì)代表性黃酮類化合物對(duì)EV71的抗病毒活性進(jìn)行了研究。單純性皰疹病毒2型(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)是引起生殖器皰疹的主要病原體,并具有終身潛伏性;HSV-2還能夠增加感染人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)以及罹患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。臨床上的主要治療方法為基于阿昔洛韋(Acyclovir)或其前藥的化學(xué)療法;然而,耐藥性以及嚴(yán)重的毒副作用限制了阿昔洛韋的使用。目前,在研的化合物多數(shù)由于毒副作用而被迫停止研究。因此,開發(fā)安全有效的替代性HSV-2的抗病毒化合物迫在眉睫。ABMA是通過細(xì)胞高通量篩選(High-throughput screening,HTS)的方法得到的另一類蛋白毒素抑制劑,并對(duì)多種病原體具有抑制活性。ABMA通過靶向宿主細(xì)胞內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)(Host-endosomal trafficking)而發(fā)揮抑制作用,而細(xì)胞內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)屬于細(xì)胞囊泡運(yùn)輸(Intracellular vesicle transport)的范疇,參與了HSV-2生命周期中包括內(nèi)吞進(jìn)入(Endocytic entry)及包膜包封(Envelopment)的數(shù)個(gè)重要過程,為ABMA作為HSV-2潛在的抗病毒藥物的研究提供了可行性。因此,本論文對(duì)ABMA對(duì)HSV-2的抗病毒作用進(jìn)行了研究。本研究分為以下三個(gè)部分:第一部分:Retro-2~(cycl)和Retro-2.1對(duì)EV71的抗病毒作用研究首先,我們建立了EV71的293S細(xì)胞感染模型,基于此模型通過細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)及病毒空斑(Plaque formation)效應(yīng)實(shí)驗(yàn),得到Retro-2~(cycl)和Retro-2.1的選擇性指數(shù)分別為:39.81和5356。隨后,我們通過檢測(cè)不同的給藥方式對(duì)抑制活性的影響,發(fā)現(xiàn)Retro-2~(cycl)及Retro-2.1的有效作用階段為EV71生命周期的晚期階段,可能阻斷了子代病毒的包裝或釋放;在EV71子代病毒包裝及釋放階段(5–16 h)給藥,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外病毒滴度降低,而細(xì)胞內(nèi)病毒滴度升高,證明Retro-2~(cycl)及Retro-2.1是通過阻斷子代病毒的釋放而發(fā)揮作用的;此外,還在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Retro-2~(cycl)和Retro-2.1將EV71由細(xì)胞膜下的累積轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)中的均勻分布,直觀地驗(yàn)證了該抑制作用。最后,我們建立了EV71的BALB/c乳鼠致死感染模型,對(duì)Retro-2~(cycl)對(duì)EV71的體內(nèi)抗病毒效果進(jìn)行評(píng)價(jià)(由于Retro-2.1的水溶性較低,僅對(duì)Retro-2~(cycl)進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn),提高Retro-2.1水溶性的優(yōu)化正在進(jìn)行中);發(fā)現(xiàn)Retro-2~(cycl)在10 mg/kg的劑量下,能夠使致死劑量EV71感染的乳鼠的生存率提高至90%。綜上所述,該部分研究證明了Retro-2~(cycl)及Retro-2.1為EV71的體內(nèi)外有效制劑,并初步闡明了其作用機(jī)制:阻斷細(xì)胞囊泡運(yùn)輸參與的子代病毒的釋放;由于Retro-2~(cycl)的大量衍生物已經(jīng)被報(bào)道,該部分研究可為EV71抗病毒藥物的研究提供了先導(dǎo)化合物;由于Retro-2~(cycl)及Retro-2.1的作用靶點(diǎn)為細(xì)胞囊泡運(yùn)輸而非病毒本身,降低了產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn);由于Retro-2~(cycl)及Retro-2.1被報(bào)道對(duì)多種病原體均具有抑制作用,本部分研究進(jìn)一步地?cái)U(kuò)大了病原體的范圍,為Retro-2~(cycl)及Retro-2.1發(fā)展為廣譜性藥物提供了依據(jù),并且提示:細(xì)胞囊泡運(yùn)輸可以作為有效的抗病毒靶點(diǎn)。第二部分:黃酮類化合物對(duì)EV71的抗病毒作用研究首先,我們對(duì)9種黃酮類化合物的體外活性進(jìn)行檢測(cè),為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的用藥劑量提供參考;結(jié)果顯示,9種化合物的選擇性指數(shù)均高于4;其中,7-羥基黃酮的治療指數(shù)為12215.79,具有最佳開發(fā)潛力。隨后,我們選擇適宜的劑量對(duì)化合物的體內(nèi)抑制活性進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)9種化合物均對(duì)EV71的體內(nèi)感染具有顯著性的保護(hù)作用;其中,7-羥基黃酮在0.2 mg/kg的低劑量下可達(dá)到66.67%的保護(hù)率,異鼠李素在10 mg/kg的劑量下可達(dá)100%的保護(hù)率,具有最佳開發(fā)潛力。綜上所述,該部分研究發(fā)現(xiàn)了異鼠李素對(duì)EV71的抗病毒作用;證明了9種黃酮類化合物的體內(nèi)有效性;在同一體系中對(duì)9種黃酮類化合物對(duì)EV71的抗病毒活性進(jìn)行研究,為化合物間的比較提供了依據(jù);證明了7-羥基黃酮及異鼠李素為具有較大抗EV71潛力的黃酮類化合物。第三部分:ABMA對(duì)HSV-2的抗病毒作用研究首先,我們建立了HSV-2的Vero細(xì)胞感染模型,基于此模型通過細(xì)胞病變(Cytopathic effect,CPE)及病毒空斑(Plaque formation)效應(yīng)實(shí)驗(yàn),得到了ABMA的選擇性指數(shù)為:20.93;并通過基于病毒水平的核酸及蛋白含量檢測(cè)驗(yàn)證了其有效性。隨后,我們通過檢測(cè)不同的給藥方式對(duì)抑制活性的影響,發(fā)現(xiàn)ABMA對(duì)HSV-2的有效作用階段為生命周期的早期及晚期階段;通過病毒的吸附與進(jìn)入實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ABMA作用于HSV-2早期階段的進(jìn)入過程,并在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),ABMA將HSV-2由細(xì)胞核內(nèi)及核周分布轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞膜外分布,直觀地證明了該抑制作用;此外,通過在HSV-2晚期階段(6–18 h)給藥,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外病毒滴度均顯著性地降低,而HSV-2的包裝及釋放發(fā)生在感染5 h之后,是在晚期階段最有可能被抑制的過程。最后,我們建立了HSV-2的BALB/c雌鼠感染模型,對(duì)ABMA的體內(nèi)抗病毒效果進(jìn)行評(píng)價(jià),ABMA在5 mg/kg的劑量下,使HSV-2生殖道攻毒后的小鼠存活率由8.33%提高至50%。綜上所述,該部分研究證明了ABMA為HSV-2的體內(nèi)外有效抑制劑,并初步闡明了其作用機(jī)制為:阻斷細(xì)胞囊泡運(yùn)輸參與的HSV-2的進(jìn)入過程及生命周期晚期過程,為HSV-2的抗病毒藥物提供了先導(dǎo)化合物;由于ABMA的作用靶點(diǎn)為細(xì)胞囊泡運(yùn)輸過程,而非病毒本身,降低了產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn);由于ABMA對(duì)多種病原體均具有抑制活性,該部分研究進(jìn)一步地?cái)U(kuò)大了病原體的范圍,為ABMA發(fā)展為廣譜性藥物提供了依據(jù),并提示:細(xì)胞囊泡運(yùn)輸可以作為有效的抗病毒靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R373
【圖文】：

第 1 章 Retro-2cycl和 Retro-2.1 對(duì) EV71 的抗病毒作用研究第 1 章 Retro-2cycl和 Retro-2.1 對(duì) EV71 的抗病毒作用研究第 1 節(jié) 前言1.1 手足口病簡(jiǎn)介1.1.1 手足口病臨床癥狀手足口病（Hand, foot and mouth disease, HFMD）以其普遍臨床癥狀命名，主要感染年齡在 5 歲以下的嬰幼兒，并通過糞便及鼻咽分泌液傳播。該疾病潛伏期為 3 - 7 天，主要癥狀為發(fā)燒、淋巴結(jié)腫大，隨后 1 - 2 天在手掌、足底及口舌部位出現(xiàn)丘疹或水泡，一般為自愈性[1, 2]。然而，在一些患者中會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如無菌性腦炎、腦干腦炎、腦膜炎、神經(jīng)性肺水腫、循環(huán)系統(tǒng)障礙及弛緩性麻痹，進(jìn)而導(dǎo)致永久性損傷甚至死亡[3, 4]。

圖 1.2 腸道病毒基因組圖解上：腸道病毒基因組，下：腸道病毒多聚蛋白加工模式[12]在病毒復(fù)制過程中，首先直接翻譯產(chǎn)生一個(gè)由 2193 個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白；該多聚蛋白不斷地被非結(jié)構(gòu)蛋白 2A 蛋白酶切割形成 P1 和 P2-3 兩個(gè)前體蛋白[18]，而 P1 進(jìn)一步地被非結(jié)構(gòu)蛋白 3C 蛋白酶及 3DRNA 聚合酶剪切形成 VP1，VP3 及 VP0，組裝形成前體衣殼結(jié)構(gòu)[19]；在 RNA 進(jìn)入后，VP0 進(jìn)一步裂解為VP2 及 VP4，VP1-VP3 暴露在衣殼表面形成反向平行的 β-筒狀結(jié)構(gòu)，而 VP4 則包裹進(jìn)入衣殼內(nèi)，最終形成 60 拷貝的正二十面體。

圖 1.2 腸道病毒基因組圖解上：腸道病毒基因組，下：腸道病毒多聚蛋白加工模式[12]在病毒復(fù)制過程中，首先直接翻譯產(chǎn)生一個(gè)由 2193 個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白；該多聚蛋白不斷地被非結(jié)構(gòu)蛋白 2A 蛋白酶切割形成 P1 和 P2-3 兩個(gè)前體蛋白[18]，而 P1 進(jìn)一步地被非結(jié)構(gòu)蛋白 3C 蛋白酶及 3DRNA 聚合酶剪切形成 VP1，VP3 及 VP0，組裝形成前體衣殼結(jié)構(gòu)[19]；在 RNA 進(jìn)入后，VP0 進(jìn)一步裂解為VP2 及 VP4，VP1-VP3 暴露在衣殼表面形成反向平行的 β-筒狀結(jié)構(gòu)，而 VP4 則包裹進(jìn)入衣殼內(nèi)，最終形成 60 拷貝的正二十面體。
【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Xiaobo Lei;Sheng Cui;Zhendong Zhao;Jianwei Wang;;Etiology, pathogenesis, antivirals and vaccines of hand,foot, and mouth disease[J];National Science Review;2015年03期

本文編號(hào)：2894413