背景及目的煙曲霉(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)是一種廣泛存在于我們生活環(huán)境中重要致病菌,可以引起人類、畜及禽類的感染,最常見(jiàn)的感染是肺部感染。A.fumigaius可以產(chǎn)生分生孢子,直徑只有2-3μm,被吸入肺部后,可到達(dá)肺泡,隨后出芽,產(chǎn)生菌絲,侵犯肺組織。肺部感染可因宿主免疫狀態(tài)、肺部疾病狀況、吸入煙曲霉總量及頻率的不同,產(chǎn)生不同類型的感染,如侵襲性曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillosis,IA)、慢性肺曲霉菌病(chronic pulmonary aspergillosis,CPA)、變應(yīng)性支氣管肺曲霉菌病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)等。其中,IA及ABPA已有較多研究,其發(fā)病機(jī)制及治療方法也比較明確,而由于缺少動(dòng)物模型,CPA的發(fā)病機(jī)制及治療手段研究較少。CPA主要發(fā)生于免疫力正常但有基礎(chǔ)肺病(肺結(jié)核)或有輕度免疫力下降的患者。CPA死亡率非常高,已成為全球范圍內(nèi)威脅人類健康的疾病。因此,建立CPA的動(dòng)物模型勢(shì)在必行。之前已有學(xué)者嘗試著建立CPA的模型,他們通過(guò)將包裹在瓊脂球中的A.fumigatus孢子接種至小鼠肺部,使之不易被清除,建立了長(zhǎng)達(dá)28天的肺部煙曲霉感染模型。然而,在這個(gè)模型中,包裹在瓊脂球中的煙曲霉無(wú)法與免疫細(xì)胞進(jìn)行充分的接觸,且瓊脂本身可引起肺部的免疫反應(yīng),這兩點(diǎn)使得他們所檢測(cè)的免疫反應(yīng)出現(xiàn)較大的偏差。在2015年,我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)從一名有肺結(jié)核病史的CPA患者肺組織中分離出了一株不產(chǎn)孢、只有菌絲形態(tài)的煙曲霉。此外,由于在CPA病程中,A.fumigatus也主要是以菌絲形態(tài)慢性定植于小鼠肺部,因此建立肺部A.fumigatus菌絲慢性定植的動(dòng)物模型,對(duì)于研究CPA的發(fā)病機(jī)制及治療手段的評(píng)價(jià)具有重要參考意義。此外,既往有研究證明,A.fumigatus孢子及菌絲形態(tài)可引起不同的免疫反應(yīng),但是研究結(jié)果具有較大爭(zhēng)議。因此,我們將建立肺部A.fumigatus菌絲的慢性定植模型來(lái)模擬人類CPA。另外我們以小鼠肺部A.fumigatus的孢子感染為對(duì)照,研究A.fumigatus孢子及菌絲引起不同的固有免疫及適應(yīng)性免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)方法本研究用綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)標(biāo)記A.fumigatus標(biāo)準(zhǔn)菌株Af293,并將其制作成為直徑在150-250 u m的結(jié)構(gòu)緊密的菌絲球,接種至免疫力正常的小鼠肺部,并通過(guò)小鼠肺部活體成像、小鼠肺部病理(PeriodicAcid-Schiff stain,PAS染色)及小鼠肺部真菌負(fù)荷檢測(cè)Af293在小鼠肺部存留時(shí)間,判斷小鼠是否為慢性感染。同時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠體重變化,及一般情況變化,如大小便性狀變化、毛發(fā)變化、肺部癥狀。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠肺部A.fumigatus孢子及菌絲形態(tài)感染引起的不同免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.GFP 標(biāo)記 Af293 菌株(Af293-GFP)將GFP基因序列轉(zhuǎn)染至Af293菌株的基因序列中,使Af293菌株帶有明亮的綠色熒光,且在小鼠體內(nèi)28天不會(huì)淬滅。2.Af293-GFP菌絲球的制作將Af293-GFP菌絲制作成為結(jié)構(gòu)緊密的菌絲球,其直徑為150-250 μm。3.小鼠肺部Af293-GFP分布在對(duì)照組,小鼠肺部無(wú)熒光;在肺部感染孢子組,小鼠肺部在感染后第1,7天可見(jiàn)綠色熒光,7天之后無(wú)熒光;在肺部感染菌絲球組,小鼠肺部在感染后1,7,14,21及28天均可見(jiàn)綠色熒光:在感染后第1天及第7天,小鼠肺部熒光較強(qiáng);從第14天至21天,小鼠肺部熒光一直較弱;而在感染后第28天,小鼠肺部熒光明顯強(qiáng)于第14天及第21天,且熒光明顯變得彌散。4.小鼠肺部病理結(jié)果(PAS染色)在孢子感染組,感染后第1天,病理結(jié)果可見(jiàn)煙曲霉Af293孢子被巨噬細(xì)胞吞噬;感染后第7天,病理結(jié)果顯示氣管腔內(nèi)大量品紅色氣管分泌物;感染后14、21及28天,小鼠病理結(jié)果均未見(jiàn)明顯異常。在菌絲球感染組,菌絲可在小鼠肺部存留長(zhǎng)達(dá)28天。在小鼠感染菌絲球后第1天,大量的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞均被募集至感染區(qū);在感染后第7天,氣管腔內(nèi)的菌絲球生長(zhǎng)為較大的菌絲塊,充滿支氣管管腔,菌絲塊內(nèi)有大量的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn);在感染后第14、21天,管腔內(nèi)大部分煙曲霉菌絲已被清除,且氣管腔壁已被破壞,感染區(qū)被大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞包饒;感染后第28天,感染區(qū)為大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),肺部出現(xiàn)實(shí)變。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)感染病灶局限,均未見(jiàn)菌絲侵襲肺間質(zhì)及肺部血管。這與人類CPA病理表現(xiàn)相類似。5.小鼠肺部真菌負(fù)荷在孢子感染組,小鼠肺部真菌負(fù)荷逐漸減少。在菌絲球感染組,小鼠肺部真菌負(fù)荷在感染后第1天及第7天幾乎維持不變,表明了小鼠肺部煙曲霉在被炎癥細(xì)胞吞噬的同時(shí),也有一定的生長(zhǎng);在感染后第14、21天,小鼠肺部真菌負(fù)荷維持不變,但相較于第7天明顯下降;而在感染后第28天,小鼠肺部真菌負(fù)荷有了較大的增長(zhǎng),表明了小鼠肺部真菌感染出現(xiàn)了復(fù)燃,這與人類CPA具有高復(fù)發(fā)率相吻合。6.小鼠體重變化及一般情況觀察未感染組、孢子感染組及菌絲球感染組的小鼠體重變化趨勢(shì)無(wú)明顯差異。三組小鼠均未出現(xiàn)大小便性狀變化、皮毛雜亂及喘息等呼吸道癥狀。此外,三組小鼠在接種24小時(shí)之后,均未出現(xiàn)死亡。7.固有免疫研究結(jié)果固有免疫主要探究了巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞在煙曲霉感染中的作用。在孢子感染組,接種后支氣管腔內(nèi)出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞及少量的中性粒細(xì)胞,且在感染后第7天,兩種細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大值,之后則逐漸降低。在管腔周圍,整個(gè)感染過(guò)程中均未見(jiàn)巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),而在感染后第28天,管腔周圍有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。在菌絲球感染組,感染后支氣管腔內(nèi)聚集有大量巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞,且在感染后第7天數(shù)量達(dá)到最大值,隨后逐漸降低。在管腔周圍,同樣有大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。其中,巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞在感染后第1天數(shù)量達(dá)到最大值,其后即逐漸下降。而中性粒細(xì)胞數(shù)量在感染后第7天達(dá)到頂峰,其后逐漸下降。8.適應(yīng)性免疫研究結(jié)果在孢子感染組,Th1、Th2及Th17細(xì)胞數(shù)量均從感染后第1天開始增加,至第7天達(dá)到最大值,之后逐漸下降,但仍高于未感染組。這與既往研究結(jié)果不相符,而從感染后第1天至第21天,孢子感染組Treg細(xì)胞均高于未感染組。在菌絲球感染組,在整個(gè)感染過(guò)程中,Th1細(xì)胞均未見(jiàn)升高,而Th2及Th17細(xì)胞在感染后第7天有一過(guò)性的升高,后逐漸降低。Treg細(xì)胞在感染后第1天即升高,在第7天達(dá)到最大值,隨后逐漸降。結(jié)論本研究建立了一個(gè)肺部A.fumigatus菌絲慢性定植的小鼠模型來(lái)模擬人類CPA,為研究CPA的發(fā)病機(jī)制及新的治療方法提供了動(dòng)物模型,也為不產(chǎn)孢煙曲霉引起的CPA的研究提供了動(dòng)物模型。此外,此研究也探討了煙曲霉孢子及菌絲引起的不同的免疫反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R519;R-332
【部分圖文】：
－２０°Ｃ儲(chǔ)存。??３．實(shí)驗(yàn)結(jié)果??３．１插入ＧＦＰ片段引物擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳（見(jiàn)圖２．１），?ＤＮＡ片段長(zhǎng)７７９ｂｐ。??■??圖２．１插入ＧＦＰ片段引物擴(kuò)增產(chǎn)物，ＤＮＡ長(zhǎng)度為７７９ｂｐ。??３．２轉(zhuǎn)化后大腸桿菌菌落ＰＣＲ產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳（見(jiàn)圖２．２），ＤＮＡ片段長(zhǎng)??１５２５ｂｐ�？梢�(jiàn)所挑選的１２個(gè)菌落均轉(zhuǎn)化成功。??ＢＢＢ８Ｉ??圖２．２?１２個(gè)轉(zhuǎn)化后大腸桿菌菌落ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物，ＤＮＡ長(zhǎng)度為１５２５ｂｐ。??３．３熒光顯微鏡下ＧＦＰ陽(yáng)性／１只９３菌株Ｕ／２９３－ＣＦＰ）（見(jiàn)圖２．３），可觀察到??Ｚ１／２９３－ＧＦＰ菌株的孢子及菌絲均帶有較強(qiáng)的綠色熒光。??４１??
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2893372
