發(fā)布時(shí)間：2020-11-13 02:09

　　 目的:阪崎桿菌(Enterobacter sakazakii)是一種條件致病菌。它常常引起新生兒與早產(chǎn)兒致死性腦膜炎、腦膜腦炎、壞死性結(jié)腸炎(NEC)和敗血癥。致死率可達(dá)到40%-80%,雖然通過(guò)使用抗生素治療可以使患兒康復(fù),但常常伴有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥及發(fā)育障礙等癥狀。目前僅知道嬰幼兒奶粉是可能的致病菌來(lái)源。在2004年發(fā)生的安徽阜陽(yáng)劣質(zhì)嬰幼兒配方奶粉事件,引起我國(guó)政府高度重視,并且首次從87份嬰幼兒配方奶粉中分離出11株阪崎桿菌,檢出率高達(dá)12.6%。到現(xiàn)在為止,關(guān)于阪崎桿菌的毒力因素及其致病機(jī)制了解的很少,文獻(xiàn)提示阪崎桿菌致病原因大多和內(nèi)毒素及類(lèi)腸毒素有關(guān)。為了更好了解阪崎桿菌對(duì)人類(lèi)的致病性,評(píng)估潛在的毒性因子是必需的。然而,關(guān)于阪崎桿菌的致病機(jī)制與病理機(jī)制目前尚不清楚。而微生物病原體成功粘附、侵襲、定居、生存在宿主的表面諸如粘膜、胃腸道的內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞是引起疾病的關(guān)鍵一步。因此,病原微生物識(shí)別和結(jié)合到細(xì)胞表面特定的受體部分是其一種普通的特性,是細(xì)菌對(duì)抗宿主限制其聚集的一種策略。因此對(duì)細(xì)胞特定的附著力,被認(rèn)為是致病菌的最重要的毒性因子。細(xì)菌侵襲入腦是其致腦膜炎的關(guān)鍵一步。血腦屏障主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、完整基膜和神經(jīng)膠質(zhì)膜構(gòu)成,是腦和循環(huán)系統(tǒng)之間的一個(gè)代謝和生理性屏障結(jié)構(gòu),血腦屏障的主要功能在于防止循環(huán)中的有毒物質(zhì)比如藥物、毒素等進(jìn)入腦內(nèi),維持腦中內(nèi)環(huán)境相對(duì)恒定,從而保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷。通過(guò)體外分離培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMECs),模擬血腦屏障,可以作為研究血腦屏障功能的理想對(duì)象。研究發(fā)現(xiàn),某些致病菌可以在宿主細(xì)胞附近分泌的效應(yīng)分子,引起宿主細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架變化,有利于病原菌通過(guò)宿主細(xì)胞細(xì)胞骨架的變化而粘附于宿主細(xì)胞表面、侵襲進(jìn)人宿主細(xì)胞、在宿主細(xì)胞內(nèi)和宿主細(xì)胞間進(jìn)行遷徙,最后形成吞飲泡,避免被吞噬。細(xì)胞骨架由微絲、微管及中間纖維組成,它參與細(xì)胞的多種功能,并參與調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),感興趣的是,Kim KS等研究指出E.coli K1與HBMECs上的受體相互作用,在細(xì)菌的粘附處誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲凝集。研究發(fā)現(xiàn)HBMECs的FAK(focal adhension kinase)、PI3K、Rho GTPase和PKC的活化等細(xì)胞骨架組裝調(diào)控信號(hào)分子與E.coli K1侵襲密切相關(guān),但是關(guān)于阪崎桿菌與HBMECs作用目前沒(méi)有報(bào)道。那么阪崎桿菌是否侵襲HBMECs?在侵襲的過(guò)程細(xì)胞骨架系統(tǒng)是否參與?在侵襲的過(guò)程中,HBMECs的一些信號(hào)通路諸如PI3K與ERK是否活化呢?以上這些問(wèn)題與阪崎桿菌的致病機(jī)理密切相關(guān),通過(guò)對(duì)上述問(wèn)題的解決,我們可以尋找預(yù)防和治療阪崎桿菌引起的腦膜炎等相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法,為進(jìn)一步研究阪崎桿菌的致病機(jī)理打下扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。因此,本文主要針對(duì)上述問(wèn)題的解決展開(kāi)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。方法:1研究阪崎桿菌對(duì)HBMECs侵襲及其與HBMECs作用所引起細(xì)胞骨架的變化1.1細(xì)胞培養(yǎng)HBMECs培養(yǎng)于各含10%新生牛血清和胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。1.2細(xì)菌培養(yǎng)阪崎桿菌、E44、HB101培養(yǎng)在含相應(yīng)的抗生素的BHI培養(yǎng)液中。1.3阪崎桿菌的特性1.4侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阪崎桿菌、E44、HB101對(duì)HBMECs的侵襲能力1.5侵襲實(shí)驗(yàn)應(yīng)用侵襲實(shí)驗(yàn)分析不同濃度的微絲抑制劑細(xì)胞松弛素D對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的能力的影響。1.6侵襲實(shí)驗(yàn)應(yīng)用侵襲實(shí)驗(yàn)分析不同濃度的微管抑制劑秋水仙素對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的能力的影響。1.7免疫熒光檢測(cè)阪崎桿菌侵襲HBMECs,HBMECs微絲的變化。1.8免疫熒光檢測(cè)阪崎桿菌侵襲HBMECs,HBMECs微管的變化2探討阪崎桿菌侵襲HBMECs依賴(lài)PI3K的活化的作用機(jī)制2.1細(xì)胞培養(yǎng)HBMECs培養(yǎng)于各含10%新生牛血清和胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。2.2細(xì)菌培養(yǎng)阪崎桿菌、E44、HB101培養(yǎng)含適當(dāng)?shù)目股�素的BHI培養(yǎng)液中。2.3應(yīng)用侵襲實(shí)驗(yàn)分析不同信號(hào)通路抑制劑對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的影響2.3.1侵襲實(shí)驗(yàn)分析不同濃度的PI3K抑制劑LY294002與Wortmannin對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的影響。2.3.2侵襲實(shí)驗(yàn)分析不同濃度的PKC抑制劑G?6976對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的影響。2.3.3侵襲實(shí)驗(yàn)分析不同濃度的Src抑制劑PP1與PP2對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的影響。2.3.4侵襲實(shí)驗(yàn)分析不同濃度的ROCK抑制劑Y27632對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的影響。2.4應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)阪崎桿菌侵襲HBMECs過(guò)程中PI3K信號(hào)分子的活化情況。2.5免疫熒光檢測(cè)阪崎桿菌侵襲HBMECs,PI3K抑制劑LY294002與Wortmannin對(duì)HBMECs微絲的變化。2.6免疫熒光檢測(cè)阪崎桿菌侵襲HBMECs,PI3K抑制劑LY294002與Wortmannin對(duì)HBMECs微管的變化2.7應(yīng)用侵襲實(shí)驗(yàn)分析、Western-blot方法及免疫熒光檢測(cè)PI3K缺失突變株△110對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的影響2.7.1應(yīng)用侵襲實(shí)驗(yàn)分析PI3K缺失突變株△110對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的影響。2.7.2應(yīng)用Western-blot方法分析PI3K缺失突變株△110對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的影響。2.7.3應(yīng)用免疫熒光分析PI3K缺失突變株△110對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs微絲的變化。2.8應(yīng)用侵襲實(shí)驗(yàn)分析、Western-blot方法及免疫熒光檢測(cè)cPLA2a在阪崎桿菌侵襲HBMECs的作用。2.8.1應(yīng)用侵襲實(shí)驗(yàn)分析PLA2是否參與了阪崎桿菌侵襲。2.8.2利用免疫熒光化學(xué)的方法檢測(cè)cPLA2a是否參與了阪崎桿菌引發(fā)的肌動(dòng)蛋白的重排。2.8.3采用侵襲實(shí)驗(yàn)、Western-blot方法,用Akt抑制劑、AACOCF3或兩種藥物共同處理HBMECs研究阪崎桿菌侵襲HBMECs過(guò)程中信號(hào)通路PI3K/Akt和cPLA2a之間的關(guān)系。3探討阪崎桿菌在侵襲HBMECs的過(guò)程中ERK活化的作用機(jī)制3.1細(xì)胞培養(yǎng)HBMECs培養(yǎng)于各含10%新生牛血清和胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。3.2細(xì)菌培養(yǎng)阪崎桿菌、E44、HB101培養(yǎng)在含適當(dāng)?shù)目股�素的BHI培養(yǎng)液中。3.3應(yīng)用侵襲實(shí)驗(yàn)分析不同濃度的ERK抑制劑PD98059對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的影響。3.4應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)阪崎桿菌侵襲HBMECs過(guò)程中ERK信號(hào)分子的活化情況。3.5應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)使用ERK抑制劑PD98059預(yù)處理HBMECs后,阪崎桿菌侵襲HBMECs過(guò)程中HBMECs微絲的變化。3.6應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)使用ERK抑制劑PD98059預(yù)處理HBMECs后,阪崎桿菌侵襲HBMECs過(guò)程中HBMECs微管的變化。3.7ERKsiRNAs瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBMECs對(duì)阪崎桿菌侵襲HBMECs的變化。3.7.1通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將ERKsiRNAs分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBMECs,用Western-blot法鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中ERK的表達(dá)情況。3.7.2通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將ERKsiRNAs和空白對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到24孔板中,48h后阪崎桿菌侵襲HBMECs的變化。3.7.3通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將ERKsiRNAs和空白對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到6孔板中,48h后免疫熒光方法檢測(cè)阪崎桿菌侵襲HBMECs微絲的變化。結(jié)果:1阪崎桿菌侵襲人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞1.1阪崎桿菌的生物學(xué)特性阪崎桿菌在DFI(一種特異的顯色培養(yǎng)基)瓊脂顯示藍(lán)綠色菌落特征。1.2阪崎桿菌侵襲人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞阪崎桿菌能夠侵襲人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,其侵襲能力與已知的腦膜炎致病菌E.coliK1的侵襲能力一樣。1.3微絲抑制劑細(xì)胞松馳素D可以抑制阪崎桿菌侵襲HBMECs,而不影響其粘附細(xì)胞松馳素D抑制阪崎桿菌侵襲HBMECs具有劑量依賴(lài)效應(yīng)。1.4微管抑制劑秋水仙素可以抑制阪崎桿菌侵襲HBMECs,而不影響其粘附秋水仙素抑制阪崎桿菌侵襲HBMECs具有劑量依賴(lài)效應(yīng)。1.5阪崎桿菌侵襲HBMECs可以使HBMECs的細(xì)胞骨架微絲發(fā)生重排。阪崎桿菌侵襲HBMECs可引起宿主細(xì)胞骨架微絲解聚,重新分布。1.6阪崎桿菌可以使HBMECs的細(xì)胞骨架微管網(wǎng)斷裂重排。阪崎桿菌侵襲HBMECs可引起宿主細(xì)胞骨架微管解聚,重新分布。2阪崎桿菌侵襲人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞依賴(lài)PI3K的活化2.1 PI3K抑制劑LY294002與Wortmannin明顯抑制阪崎桿菌侵襲HBMECs,PKC抑制劑G?6976抑制阪崎桿菌侵襲HBMECs;Src、ROCK抑制劑不能阻斷阪崎桿菌侵襲HBMECs。2.1.1 PI3K抑制劑LY294002與Wortmannin阻抑阪崎桿菌侵襲HBMECs,并且是以劑量依賴(lài)模式;2.1.2 PKC G?6976阻抑阪崎桿菌侵襲HBMECs,只在高濃度才有比較明顯的抑制作用;2.1.3 Src抑制劑PP1與PP2不影響阪崎桿菌侵襲HBMECs;2.1.4 ROCK抑制劑Y27632不影響阪崎桿菌侵襲HBMECs。2.2阪崎桿菌侵襲HBMECs導(dǎo)致HBMECs的PI3K活化。2.2.1阪崎桿菌侵襲HBMECs的不同時(shí)間,Western-Blot檢測(cè)Akt的磷酸化情況,發(fā)現(xiàn)在侵襲15min時(shí),Akt的磷酸化明顯升高。2.2.2 PI3K的抑制劑LY294002或wortmannin預(yù)處理HBMECs 30min后,發(fā)現(xiàn)Akt的磷酸化沒(méi)有變化。2.3 PI3K抑制劑可以消除阪崎桿菌侵襲HBMECs時(shí)的微絲變化。2.4 PI3K抑制劑可以消除阪崎桿菌侵襲HBMECs時(shí)的微管變化。2.5 Dominant-negative PI3K(Δp110)可以抑制阪崎桿菌侵襲HBMECs,并能消除阪崎桿菌所引起的F-actin變化以及Akt的磷酸化。2.5.1侵襲實(shí)驗(yàn):檢測(cè)阪崎桿菌侵襲PI3K缺失突變的HBMECs(即PI3K△P110)的能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Δp110可以明顯地抑制阪崎桿菌侵襲HBMECs。2.5.2 Western-blot方法:檢測(cè)PI3K缺失突變的HBMECs(即PI3K△P110)在阪崎桿菌侵襲HBMECs時(shí)的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Δp110能抑制阪崎桿菌引起的Akt的磷酸化。2.5.3熒光方法觀察阪崎桿菌侵襲PI3K缺失突變株的HBMECs(PI3K/△P110)的細(xì)胞骨架—微絲的變化,結(jié)果證實(shí)Δp110能消除阪崎桿菌所引起的F-actin變化。2.6 cPLA2a與阪崎桿菌侵襲HBMECs有關(guān)。并且阪崎桿菌侵襲HBMECs時(shí)會(huì)激活cPLA2a。2.7 cPLA2a是PI3K/Akt信號(hào)通路中阪崎桿菌侵入HBMECs的下游效應(yīng)物。3阪崎桿菌侵襲人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與ERK的活化有關(guān)3.1 ERK抑制劑PD98059抑制阪崎桿菌侵襲HBMECs。ERK抑制劑PD98059阻抑阪崎桿菌侵襲HBMECs,并且是以劑量依賴(lài)模式3.2阪崎桿菌侵襲HBMECs導(dǎo)致HBMECs的ERK活化。3.2.1阪崎桿菌侵襲HBMECs的不同時(shí)間,Western-Blot檢測(cè)ERK的磷酸化情況,發(fā)現(xiàn)在侵襲10min時(shí),ERK的磷酸化明顯升高。3.2.2 ERK的抑制劑PD98059預(yù)處理HBMECs30min后,發(fā)現(xiàn)ERK的磷酸化不發(fā)生變化。3.3 ERK抑制劑可以消除阪崎桿菌侵襲HBMECs時(shí)的微絲變化。3.4 ERK抑制劑可以消除阪崎桿菌侵襲HBMECs時(shí)的微管變化。3.5 ERK siRNAs瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HBMECs后,可抑制阪崎桿菌侵襲HBMECs,而且可以消除阪崎桿菌侵襲HBMECs時(shí)的微絲變化。結(jié)論:阪崎桿菌侵襲進(jìn)入HBMECs依賴(lài)于HBMECs細(xì)胞骨架的重排;通過(guò)PI3K活化,引起HBMECs的細(xì)胞骨架變化,促進(jìn)阪崎桿菌侵襲HBMECs;阪崎桿菌侵襲HBMECs還與ERK的活化有關(guān),ERK活化也導(dǎo)致HBMECs的細(xì)胞骨架變化,但PI3K與ERK活化的關(guān)系及具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R378
【部分圖文】：

崎桿菌株在 DFI 瓊脂平板顯示藍(lán)綠色菌落桿菌與 E.coli K1 生化反應(yīng)特性。用法國(guó)梅里埃公司 VTEK 2 COMPA.coli K1 的生化反應(yīng)特性，結(jié)果見(jiàn)表L-賴(lài)氨酸脫羧（48，LDC）反應(yīng)陰性酸鹽水解（36，CIT）反應(yīng)陽(yáng)性，Dli K1 不能產(chǎn)生黃色素，L-賴(lài)氨酸脫羧ODC）反應(yīng)陽(yáng)性，檸檬酸鹽水解（36反應(yīng)陽(yáng)性。從表中可以看出阪崎桿。表 3.2 阪崎桿菌生化反

分別進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次三個(gè)復(fù)孔，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。3.3 微絲抑制劑 Cytochalasin D 可以抑制阪崎桿菌侵襲 HBMECs，而不影響其粘附細(xì)菌為了侵襲宿主細(xì)胞，往往誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的細(xì)胞骨架發(fā)生改變。我們已經(jīng)知道阪崎桿菌可以侵襲 HBMECs，為了進(jìn)一步研究細(xì)胞骨架—微絲在阪崎桿菌侵襲 HBMECs 的作用，我們采用微絲抑制劑—細(xì)胞松弛素 D（cytochalasin D，一種特異的 actin 解聚劑）不同濃度處理 HBMECs 單層 30min 后，進(jìn)行阪崎桿菌侵襲、黏附實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞松弛素 D 可以明顯地抑制阪崎桿菌侵襲 HBMECs，且具有濃度依賴(lài)效應(yīng)。在細(xì)胞松弛素 D 濃度為 1μg 時(shí)，阪崎桿菌侵襲能力降低接近 50%左右，而細(xì)胞松弛素 D 濃度為 5μg 時(shí)，阪崎桿菌侵襲能力降低接近 60%；與此同時(shí)，在不同細(xì)胞松弛素 D 濃度預(yù)處理 HBMECs 單層后，不影響阪崎桿菌黏附HBMECs。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖 5。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文為了進(jìn)一步探討微管在阪崎桿菌侵襲 HBMECs 的作用，我們使用不同濃度的微管抑制劑秋水仙素（colchine，一種特異的微管解聚劑）處理 HBMECs 單層 30min后，進(jìn)行阪崎桿菌侵襲 HBMECs 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)秋水仙素明顯地抑制阪崎桿菌侵襲HBMECs，且具有劑量依賴(lài)效應(yīng)。在秋水仙素濃度為 0.5μg 阪崎桿菌侵襲能力下降 34%，而濃度到 2.5μg 時(shí)，阪崎桿菌侵襲能力下降 57%左右；與此同時(shí)，使用不同濃度的秋水仙素處理HBMECs單層，則不影響阪崎桿菌黏附HBMEC（s圖6）。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 趙偉東,陳譽(yù)華,黃勝和;大腸桿菌腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲基因ibeB的編碼產(chǎn)物為外膜蛋白前體[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2004年04期

本文編號(hào)：2881572