發(fā)布時(shí)間：2020-11-11 13:05

　　 腸道病毒71型（Enterovirus，EV71）包含單股正鏈RNA基因組，屬于小RNA病毒科（picornavirus family）腸道病毒屬成員,其感染嬰幼兒后能引起手足口�。╤and-foot-mouth disease，HFMD）。EV71基因組長(zhǎng)約7.5Kb (kilobase, Kb)，僅由一個(gè)開(kāi)放閱讀框構(gòu)成，編碼一個(gè)多聚蛋白前體,這個(gè)多聚蛋白前體能裂解成四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4），七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C和3A、3B、3C和3D）。雖然有研究表明IFN-I（type I interferon，IFN-I）能保護(hù)細(xì)胞抵抗EV71的感染，然而EV71并不誘導(dǎo)IFN-I的產(chǎn)生。最近研究發(fā)現(xiàn)EV71能夠通過(guò)阻斷RIG-I、干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulated factor7，IRF7）以及I型干擾素受體（IFN-I receptor， IFNAR）的表達(dá)來(lái)抑制干擾素誘導(dǎo)基因（Interferon-stimulated gene, ISG）的激活。 宿主通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）和病原微生物的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）的相互作用來(lái)識(shí)別病毒和入侵微生物。PRR包括了膜受體和胞質(zhì)受體。膜受體為T(mén)oll樣受體（Toll-like receptors, TLRs），而胞質(zhì)受體包括NOD樣受體（NOD-like receptor，NLRs）以及RLR樣受體（（RIG-I-like receptor，RLRs）。RLR樣受體包括RIG-I（retinoid acid-inducible gene I, RIG-I）和MDA-5(melanomadifferentiation-associated gene5, MDA-5)。RIG-I和MDA-5都包含CARD結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domains)，結(jié)合非帽化的RNA后與同樣含有CARD結(jié)構(gòu)域的線粒體抗病毒蛋白（mitochondrial antiviral signaling，MAVS）結(jié)合，導(dǎo)致MAVS和IKK激酶（I B kinase）結(jié)合，然后以此為平臺(tái)募集下游不同的信號(hào)分子組成不同的調(diào)控復(fù)合物，最終激活核因子B（nuclear factor-kappaB，NF-B）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulated factor，IRF3），進(jìn)而起始-干擾素（interferon-β，IFN-）的表達(dá)及IFN介導(dǎo)的抗病毒免疫。RIG-I信號(hào)通路受泛素化、去泛素化、磷酸化以及去磷酸化的調(diào)控。前期報(bào)道腫瘤抑制因子圓柱瘤基因（Cylindromatosis，CYLD）可以通過(guò)調(diào)控RIG-I的泛素化參與宿主的先天性免疫應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)途徑。在樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cells, DC）中缺失CYLD會(huì)誘導(dǎo)持續(xù)泛素化RIG-I，并增強(qiáng)TANK結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase1，TBK1）和IκB激酶（The IκB kinase，IKK）的活性。除了RIG-I, CYLD同樣能去除核因子Kappa B基本調(diào)節(jié)因子（Nuclear factor-Kappa B essential modulator，NEMO）、IKK、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor-associated factor2，TRAF2）以及B細(xì)胞淋巴瘤蛋白3（B-cell CLL/lymphoma3，Bcl-3）的K63位泛素化來(lái)負(fù)調(diào)控NF-B和c-Jun N末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）信號(hào)通路。這些發(fā)現(xiàn)確定了CYLD成為抗病毒先天性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)控分子。 MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)高度保守的非編碼小RNA分子，平均長(zhǎng)度為22nt（nucleotide，nt）。miRNA通過(guò)與靶基因的3’UTR（untranslational region，UTR）結(jié)合來(lái)抑制基因表達(dá)。miRNA參與調(diào)節(jié)許多生命進(jìn)程，發(fā)揮重要的作用。近來(lái)報(bào)道了在單核細(xì)胞核巨噬細(xì)胞中miRNA參與調(diào)控先天性免疫應(yīng)答，如miR-146a靶向白介素1受體相關(guān)激酶1（IL-1R associated kinase1，IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor6，TRAF6）來(lái)負(fù)調(diào)控RIG-I樣受體（RIG-I-like receptor，RLR）信號(hào)通路。然而到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于EV71通過(guò)miRNA調(diào)控RIG-I信號(hào)通路的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)： 1. miR-526a的表達(dá)受RNA病毒誘導(dǎo)激活的IRF3/7轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控：利用熒光定量PCR(quantitative polymerase chain reactin，q-PCR)的方法，發(fā)現(xiàn)RNA病毒感染可以顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)miR-526a的表達(dá)；通過(guò)RNA干涉手段，發(fā)現(xiàn)IRF3、7敲低細(xì)胞中水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）誘導(dǎo)的miR-526a上調(diào)被顯著抑制，以上結(jié)果提示我們miR-526a的表達(dá)受RNA病毒誘導(dǎo)激活的IRF3/7轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。 2. miR-526a促進(jìn)RIG-I信號(hào)通路的激活：通過(guò)合成miR-526a模擬物以及抑制劑，利用IFN-、NF-B以及IRF3報(bào)告基因活性檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以顯著增強(qiáng)RIG-I信號(hào)通路的激活，這種激活活性可以被miR-526a抑制劑阻斷；利用q-PCR以及AlphaLISA技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-526a能夠促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的IFN-的轉(zhuǎn)錄和分泌；利用q-PCR方法，發(fā)現(xiàn)miR-526a的過(guò)表達(dá)能夠激活I(lǐng)FN-的下游誘導(dǎo)基因ISG56、ISG54、白介素-8（interleukin-8，IL-8）以及趨化因子配體-2（Chemokine (C-X-C motif) ligand2，CXCL-2）的表達(dá)，以上結(jié)果顯示miR-526a是參與調(diào)控RIG-I信號(hào)通路的正調(diào)控因子。 3.miR-526a抑制VSV和NDV病毒的復(fù)制：用免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物能夠抑制VSV病毒感染后VSV-G蛋白的表達(dá)；以新城疫病毒NDV-GFP（Newcastle Disease Virus，NDV）病毒感染細(xì)胞為模型，利用熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以顯著抑制NDV病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，以上結(jié)果提示我們miR-526a可以抑制RNA病毒復(fù)制。 4.miR-526a通過(guò)靶向CYLD激活RIG-I信號(hào)通路：通過(guò)生物信息學(xué)軟件TargetScan等預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)CYLD是miR-526a潛在的靶點(diǎn)。檢測(cè)帶有不同位置的CYLD3’UTR熒光素酶報(bào)告基因的活性發(fā)現(xiàn)CYLD存在miR-526a作用位點(diǎn)；利用q-PCR以及免疫印跡方法，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物能夠下調(diào)CYLD的轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白水平。利用細(xì)胞泛素化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以增強(qiáng)病毒誘導(dǎo)的RIG-I K63位泛素化水平，而miR-526a抑制劑可以抑制病毒誘導(dǎo)的RIG-I的泛素化；利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以增強(qiáng)病毒誘導(dǎo)的IKK/、I B及IRF3的磷酸化，以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明miR-526a通過(guò)靶向CYLD增強(qiáng)RIG-I的K63位泛素化修飾，進(jìn)而激活RIG-I信號(hào)通路。 5. EV71病毒利用3C蛋白酶靶向miR-526a抑制RIG-I信號(hào)通路的激活：利用q-PCR以及免疫印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)EV71病毒感染后下調(diào)miR-526a的表達(dá)、IRF7的激活以及IFN-的產(chǎn)生，以上表型均由EV71的3C蛋白酶介導(dǎo)；通過(guò)免疫印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物及CYLD的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)能夠抑制EV71病毒的復(fù)制以及EV71VP1蛋白的表達(dá)，以上結(jié)果說(shuō)明EV71通過(guò)靶向miR-526a阻斷RIG-I信號(hào)通路的激活。 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)病毒感染巨噬細(xì)胞后能顯著上調(diào)miR-526a，并依賴(lài)IRF3/7的激活。而miR-526a通過(guò)靶向CYLD，去除RIG-I的K63位泛素化正調(diào)控VSV介導(dǎo)的IRF3和NF-B的激活。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了EV71的3C蛋白酶能夠抑制miR-526a的表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-526a能夠抑制EV71的復(fù)制。因此本研究第一次發(fā)現(xiàn)了miR-526a是RIG-I信號(hào)通路的一個(gè)正調(diào)控因子，并且EV71通過(guò)抑制miR-526a來(lái)抑制RIG-I介導(dǎo)的IFN-I產(chǎn)生。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類(lèi)】：R392
【文章目錄】：
目錄
縮略詞表
摘要
Abstract
前言
    一、EV71 逃逸宿主天然免疫與其致病性
    二、RLR 信號(hào)通路與抗病毒感染
    三、microRNA 參與先天性免疫應(yīng)答
    四、本課題研究的科學(xué)問(wèn)題
材料與方法
    1 材料
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 菌毒株、質(zhì)粒與 RNA 合成物
        1.3 常用試劑盒
        1.4 分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)試劑
        1.5 抗體
        1.6 其它化學(xué)試劑
        1.7 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 病毒擴(kuò)增
        2.2 病毒感染
        2.3 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.4 RNA 提取
        2.5 反轉(zhuǎn)錄
        2.6 熒光定量 PCR
        2.7 CYLD 3’UTR luciferase 質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.8 luciferase reporter 檢測(cè)
        2.9 免疫沉淀
        3.0 免疫印跡
        3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
        3.2 AlphaLISA 檢測(cè) IFN- 水平
        3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
結(jié)果
    1 miR-526a 的表達(dá)受 RNA 病毒誘導(dǎo)激活的 IRF3/7 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控
    2 miR-526a 促進(jìn) RIG-I 信號(hào)通路的激活
    3 miR-526a 抑制 VSV、NDV 及 EV71 病毒的復(fù)制
    4 miR-526a 通過(guò)靶向 CYLD 激活 RIG-I 信號(hào)通路
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    摘要
    Abstract
    參考文獻(xiàn)
代表性論文
個(gè)人簡(jiǎn)歷
致謝

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