發(fā)布時間：2020-11-10 04:30

　　 背景甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)是天然免疫系統(tǒng)中一個關(guān)鍵的可溶性模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR),在天然免疫系統(tǒng)中扮演至關(guān)重要的作用。輔助性T細(xì)胞17(T help cell17,Th17)是一類分泌IL-17細(xì)胞因子(IL-17是Th17細(xì)胞特異性的細(xì)胞因子)的CD4~+T細(xì)胞亞群。與MBL同為C型凝集素家族的dectin-1能夠促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。那么MBL與Th17細(xì)胞之間又有什么關(guān)系呢?是否能夠調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的分化呢?至今仍然不得而知。因此,深入研究MBL對Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響,對闡明MBL在獲得性免疫方面的新角色,具有重要意義。目的探討MBL對Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響,為Th17細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病和炎性疾病的治療提供新思路。方法1.Ficoll密度梯度離心:采用Ficoll密度梯度離心法分離人臍血單個核細(xì)胞(Cord blood mononuclear cells,CBMCs)。2.免疫磁珠分選:采用免疫磁珠分選法,從上述獲得的CBMCs中分選出CD4~+T細(xì)胞。3.流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測:對照組用anti-CD3 McAb和anti-CD28 McAb活化CD4~+T細(xì)胞并加入適當(dāng)濃度的IL-6和TGF-β1作為誘導(dǎo)劑,在對照組的基礎(chǔ)上加入不同濃度(1μg/mL、5μg/mL及10μg/mL)的MBL作為實(shí)驗(yàn)組。各組細(xì)胞培養(yǎng)72h后,利用FACS檢測各組中CD4~+RORγt~+T細(xì)胞(即Th17細(xì)胞)的比例變化情況。4.實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析:采用qRT-PCR技術(shù)分別檢測對照組和不同濃度MBL實(shí)驗(yàn)組中Th17細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子維甲酸孤兒受體-γt(Retinoid-related orphan receptor-γ-t,RORγt)mRNA表達(dá)水平。5.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測:采用ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中IL-17A的含量。6.MBL基因敲除小鼠鑒定:采用基因分型及基因測序等技術(shù)分別鑒定小鼠MBL-A基因敲除(MBL-A~(-/-))、MBL-C基因敲除(MBL-C~(-/-))、MBL-A基因和MBL-C基因雙敲除(即MBL~(-/-))情況。7.FACS檢測:采用FACS分別檢測MBL~(-/-)小鼠和WT小鼠的Th17細(xì)胞數(shù)量變化。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以xˉ±s表示,數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)以及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05,**P0.01)。結(jié)果1.MBL能夠顯著降低CD4~+RORγt~+Th17細(xì)胞的比例:FACS檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,5μg/mL MBL組及10μg/mL MBL組的CD4~+RORγt~+Th17細(xì)胞比例顯著降低。2.MBL能夠顯著降低RORγt mRNA的表達(dá):qRT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,5μg/mL MBL組及10μg/mL MBL組的RORγt mRNA的表達(dá)量顯著降低。3.MBL能夠顯著降低IL-17A的表達(dá)水平:ELISA檢測結(jié)果表明,與對照組相比,5μg/mL MBL組及10μg/mL MBL組的IL-17A分泌水平顯著降低。4.獲得MBL基因敲除小鼠:基因分型及基因測序結(jié)果顯示,成功獲得MBL-A基因敲除(MBL-A~(-/-))、MBL-C基因敲除(MBL-C~(-/-))、MBL-A基因和MBL-C基因雙敲除(MBL~(-/-))等3個品系的MBL基因敲除小鼠。5.MBL基因敲除后Th17細(xì)胞比例顯著上升:FACS檢測結(jié)果顯示,與WT小鼠相比,MBL~(-/-)小鼠CD4~+RORγt~+Th17細(xì)胞比例顯著上升。結(jié)論MBL能夠抑制CD4~+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化。
【學(xué)位單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

1 免疫磁珠分選出的 CD4+T 細(xì)胞經(jīng) FACS 檢測he percentage of CD4+T cells purified by MACS s4+T 細(xì)胞向 Th17 細(xì)胞誘導(dǎo)分化： anti-CD28mAb 處理的 CD4+T 細(xì)胞，同時加入的基礎(chǔ)上加入不同濃度的 MBL 作為實(shí)驗(yàn)組，為（6.31±0.90）%（圖 2A）；1μg/mL MBL 組為（±0.83）%（圖 2C）；10μg/mL MBL 組為（3.05±0對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；5μg/m﹤0.01）；10μg/mL MBL 組與對照組相比差異具BL 能夠抑制 Th17 細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。

33圖 2 各組細(xì)胞誘導(dǎo)后 CD4+RORγt+T 細(xì)胞的比例變化Fig 2 The percentages of CD4+RORγt+T cells in different groups after induction in vitro注：A：未加 MBL 組；B：1μg/mL MBL 組；C：5μg/mL MBL 組；D：10μg/mL MBL 組；E：統(tǒng)計(jì)分析 。1：未加 MBL 組；2：1μg/mL MBL 組；3：5μg/mL MBL 組；4：10μg/mL MBL 組3.3 MBL 抑制 Th17 細(xì)胞 RORγt mRNA 的表達(dá)：分別檢測未加 MBL 對照組以及加入不同濃度的 MBL 組：1μg/mL MBL 組，5μg/mL MBL 組，10μg/mL MBL 組。qRT-PCR 結(jié)果顯示，未加 MBL 組中 RORγt mRNA

相對定量為 1.00±0.17；1μg/mL MBL 組中 RORγt mRNA 的表達(dá)9；5μg/mL MBL 組中 RORγt mRNA 的表達(dá)量為 0.54±0.11；10μg/mL MBγt mRNA 的表達(dá)量為 0.27±0.07。1μg/mL MBL 組與對照組相比差異無統(tǒng)﹥0.05）；5μg/mL MBL 組與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.0 MBL 組與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01，圖 3C）。結(jié)果提夠抑制 Th17 細(xì)胞 RORγt mRNA 的表達(dá)。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2877478