發(fā)布時間：2020-11-08 13:27

　　 目的建立有效的提取書虱總RNA的方法。方法分別采取改良SDS法、傳統(tǒng)SDS法和TRIzol法提取書虱總RNA;采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性;核酸蛋白分析儀測定RNA純度和濃度,純度以A_(260)/A_(280)、A_(260)/A_(230)表示,通過濃度推算產率;以β-actin為目的基因,RT-PCR法初步評價RNA提取效果。同時,用改良SDS法探究不同數(shù)量的書虱總RNA提取效果。結果改良SDS法產率最高。經方差分析,3種方法的濃度差異具有統(tǒng)計學意義(F=17.874,P0.001),經SNK法每組互比,改良SDS法濃度較高,其次為TRIzol法,傳統(tǒng)SDS法較低。TRIzol法未見28s條帶;傳統(tǒng)SDS法有gDNA污染;而改良SDS法電泳結果顯示28s、18s條帶完整清晰,條帶之間無明顯彌散現(xiàn)象,說明提取的RNA完整性較高。3種方法提取的RNA經RT-PCR均能擴增出陽性條帶。30只書虱即可獲得高質量RNA,滿足后續(xù)實驗要求。結論改良SDS法操作簡單、成本低、耗時少,適于書虱總RNA的提取。
【部分圖文】：

改良SDS法、傳統(tǒng)SDS法、TRIzol法提取書虱總RNA的濃度值差異有統(tǒng)計學意義(F=17.874,P<0.001)。經SNK法每組互比,改良SDS法濃度較高,其次為TRIzol法,傳統(tǒng)SDS法較低(表1)。改良SDS法及傳統(tǒng)SDS法提取RNA的A260/A280均在理想值范圍1.8～2.0內,說明存在蛋白質污染;TRIzol法的A260/A280高于2.0。改良SDS法提取RNA 的A260/A230在理想值范圍2.0～2.2內,說明該方法可去除脂類、多糖等成分。TRIzol 法的A260/A230低于2.0,說明存在有機物質等污染。

表2 不同pH值的KAc緩沖液提取的書虱總RNA濃度和純度 pH 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 濃度(μg/μL) 0.51 0.62 0.57 1.10 1.36 1.31 1.04 A260/A280 1.95 1.94 1.99 1.98 1.98 1.96 1.97 A260/A230 2.12 2.25 2.16 2.14 2.18 2.21 2.19三、改良SDS法書虱最低適宜數(shù)量

表3 不同書虱數(shù)量提取的總RNA濃度和純度 數(shù)量 1 10 20 30 50 100 濃度(μg/μL) 0 0.08 0.19 0.38 0.62 0.77 A260/A280 0 1.89 1.92 1.98 1.98 1.95 A260/A230 0 2.01 2.06 2.10 2.16 2.13四、 RT-PCR擴增β-actin基因
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