發(fā)布時間：2020-11-06 18:54

　　 第一部分建立骨質(zhì)疏松SD大鼠動物模型目的:建立安全可靠的骨質(zhì)疏松SD大鼠動物模型。方法:選用6月齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠10只,隨機分成兩組,每組5只大鼠:模型組行雙側(cè)卵巢切除手術(shù),對照組假手術(shù)切除卵巢周圍近似體積脂肪組織,術(shù)后12周處死所有動物,對比體重、全身BMD、血清Ca~(2+)、P~(3+)和ALP濃度手術(shù)前后變化情況以及HE染色觀察椎體組織形態(tài)表現(xiàn)。結(jié)果:所有動物在術(shù)后12周體重增加,模型組增長更為顯著(P0.05);和術(shù)前相比,模型組全身BMD和血清Ca~(2+)濃度降低,血清P~(3+)和ALP濃度升高,對照組全身BMD降低,血清Ca~(2+)、P~(3+)和ALP濃度降低,兩組變化值均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示對照組動物椎體骨小梁形態(tài)規(guī)則結(jié)構(gòu)完整,模型組動物骨小梁明顯變細變窄、減少,呈碎片狀,骨髓腔間隙大,骨量明顯減少。結(jié)論:健康6月齡雌性SD大鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)后12周可以建立穩(wěn)定可靠的骨質(zhì)疏松動物模型。第二部分不同局部風險因素建立骨質(zhì)疏松SD大鼠二膦酸鹽相關(guān)性頜骨骨壞死動物模型目的:建立骨質(zhì)疏松SD大鼠二膦酸鹽相關(guān)性頜骨骨壞死動物模型并研究不同局部風險因素對BRONJ的影響。方法:選擇45只6月齡雌性SD大鼠,應(yīng)用實驗一的方法使用雙側(cè)卵巢切除術(shù)建立骨質(zhì)疏松動物模型(T0)。術(shù)后12周(T1)所有大鼠皮下注射阿侖膦酸鈉1.0mg/kg/d,連續(xù)給藥60天后(T2)隨機分成三組:Group1:對照組,不做干預(yù);Group2:ALN+拔牙組,給藥結(jié)束后拔除雙側(cè)上下頜第一磨牙;Group3:ALN+牙周刮治組,給藥后第11天用正畸結(jié)扎絲結(jié)扎雙側(cè)上下頜第一磨牙以建立慢性牙周炎模型,給藥結(jié)束后行牙周刮治術(shù)。術(shù)后2周(T3)、4周(T4)、8周(T5)分別從三組隨機抽取5只大鼠處死。結(jié)果:(1)臨床表現(xiàn)顯示Group1和Group3的發(fā)病率無統(tǒng)計學(xué)差異,Group2動物BRONJ發(fā)病率為100%,明顯高于Group1和Group3。其中上頜骨發(fā)生率為26.7%(8/30),下頜骨發(fā)生率為56.7%(17/30),高于上頜骨。體重變化與BRONJ無明顯相關(guān);(2)血清RANKL和OPG濃度隨時間發(fā)生顯著改變,但與BRONJ無明顯相關(guān),RANKL/OPG比值在T4時顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);(3)HE染色觀察BRONJ病變區(qū)骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂,骨細胞溶解導(dǎo)致大量空虛骨陷窩形成(P0.05),TRAP染色發(fā)現(xiàn)BRONJ和Non-BRONJ區(qū)域相比,破骨細胞數(shù)目顯著減少(P0.01);(4)根據(jù)骨壞死病變和軟組織損害程度對所有BRONJ動物進行分級和分期,Group1中1期發(fā)生率為1.67%(1/60);Group2中0期發(fā)生率為46.67%(28/60),1期發(fā)生率為21.67%(13/60),2期的發(fā)生率為31.67%(19/60);Group3實驗對象中1期發(fā)生率為3.33%(2/60),2期的發(fā)生率為1.67%(1/60);Group1和Group3發(fā)病率和病變程度明顯低于Group2,Group2病變程度隨著時間變化逐漸加重;(5)Micro CT顯示BRONJ病變區(qū)域有骨微裂發(fā)生,骨質(zhì)溶解破壞。時間變化對Group1和Group3均無明顯影響(P0.05);在T3時,與Group1相比,Group2的BMD、Tb.N和Tb.Sp值有顯著性差異(P0.05),Group3的Tb.Th和Tb.Sp值有顯著性差異(P0.05),Group2的BMD、BV/TV、BS/BV、Tb.N和Tb.Th值與Group3均有顯著性差異(P0.05);T4時,Group1和Group2的Tb.N值有極顯著差異(P0.01);T5時,各組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);Non-BRONJ大鼠與BRONJ大鼠Tb.N差異極為顯著(P0.01),但不同分期間無明顯差異(P0.05),BMD在BRONJ的不同分期變化差異顯著(P0.05),Tb.Th在1期和2期與正常組均有顯著差異(P0.05),0期與1期動物Tb.Sp差異顯著(P0.05)。結(jié)論:使用骨質(zhì)疏松動物模型高劑量ALN皮下注射持續(xù)給藥60天后予以拔牙干預(yù),術(shù)后2周觀察建模成功。BRONJ病變程度與時間有相關(guān)性。拔牙是BRONJ的好發(fā)因素,牙周刮治對BRONJ的發(fā)病率沒有顯著影響。血清RANKL/OPG比值變化可能與BRONJ有關(guān),但在病變早期不敏感。Tb.N和Tb.Th可能是病變早期與BRONJ相關(guān)的骨形態(tài)標志,病變區(qū)可觀察到骨微裂發(fā)生。第三部分骨質(zhì)疏松SD大鼠二膦酸鹽相關(guān)性頜骨骨壞死骨生物力學(xué)研究目的:研究骨質(zhì)疏松SD大鼠BRONJ病變區(qū)骨生物力學(xué)特性。方法:將5只按照實驗一的方法建立的骨質(zhì)疏松SD大鼠作為Group A,術(shù)后12周按1.0mg/kg/d的劑量皮下注射生理鹽水,持續(xù)給藥60天,然后拔除雙側(cè)上下頜第一磨牙,4周后予以處死。將實驗二中拔牙組中左側(cè)下頜骨未發(fā)現(xiàn)BRONJ病變的大鼠隨機抽取5只作為Group B,將實驗二中拔牙組中左側(cè)下頜骨發(fā)現(xiàn)BRONJ病變的大鼠隨機抽取5只作為Group C。取完整左側(cè)下頜骨測量幾何形態(tài)后行三點彎曲檢測研究骨生物力學(xué)研究。結(jié)果:(1)術(shù)后Group A體重明顯高于Group B和Group C,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);(2)所有大鼠下頜骨結(jié)構(gòu)的幾何形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯差異(P0.05);(3)Group A最大載荷、最大撓度和屈服撓度明顯低于Group B(P0.05),標準斜率明顯高于Group B和Group C(P0.05)。與Group B相比,Group C最大撓度顯著減少,標準斜率顯著升高(P0.05)。結(jié)論:ALN能提高OP大鼠的骨組織強度和硬度,BRONJ對下頜骨硬度沒有顯著影響,但骨強度明顯降低,這可能是BRONJ并發(fā)病理性骨折的病因之一。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R782;R-332;R580
【部分圖文】：

至 7.2～7.4，持續(xù)攪拌溶解至溶液呈清亮，再加入 500ml 0.1mol/L PBS 溶液定容至 1000ml，充分混勻后 4℃保存。甲酸脫鈣液的配制：將 500ml 無水乙醇緩慢加入 500ml 10％福爾馬林溶液，混合充分后再依次加入 150ml 甲酸和 100ml 1％鹽酸溶液，充分混勻后室溫保存。2.2 實驗方法2.2.1 主要技術(shù)路線圖（見圖 1.1）

大鼠手術(shù)方法和模型組相同，暴露腹腔后，僅切除卵巢組織附近相同體積的脂肪。術(shù)后 6h 大鼠自由攝食、飲水，室溫（25±3C°）。予以術(shù)后肌注青霉素 20萬 U（只·次），一天兩次持續(xù) 3 天。術(shù)后一周予以拆線，同等條件下飼養(yǎng)，自由攝食水，普通飼料喂養(yǎng)。術(shù)后 12 周實驗動物全身麻醉后取仰臥位固定，開胸暴露心臟，向左心室內(nèi)注射 1％肝素鈉 0.2ml 后經(jīng)左心室行主動脈插管，血管鉗固定后剪開右心耳，先以生理鹽水 150ml 快速沖洗血管，然后用 4％多聚甲醛的 0.01mol/L PBS（4℃，PH7.40）250ml 灌注固定，先快后慢，之后取大鼠椎體，置 4％多聚甲醛固定液后固定，在 4℃冰箱內(nèi)保存。多聚甲醛進入大鼠體內(nèi)，大鼠會出現(xiàn)四肢、尾的抽搐，最終以肝臟發(fā)白、內(nèi)臟鼓起即灌注好。將骨組織置于 4％中性多聚甲醛溶液中固定 48 小時，甲酸脫鈣液脫鈣直至探針可以無阻力刺入為終點，流水沖洗過夜，常規(guī)酒度梯度脫水，正丁醇透明，石蠟包埋，切成厚度為 4μm 的切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察。

術(shù)術(shù) 術(shù)術(shù)0.120.140.160.18**全MBD（/gc注：用單因素 ANOVA 進行分析。同一曲線中模型組與對照組相比，**表示差異極顯著（P＜0.01表示差異顯著（P＜0.05），不標者則為差異不顯著（P＞0.05）。圖 1.4 全身 BMD 值3.5 組織病理學(xué)檢查手術(shù)后第 12 周，實驗動物椎體 HE 染色顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠椎體骨小梁排列規(guī)則，連續(xù)性好，骨小梁較粗，縱向結(jié)構(gòu)完整，模型組大鼠骨小梁明顯變細變窄，骨小梁間隙變寬，骨髓腔間隙變大，骨量明顯減少，發(fā)生 OP 樣改變（見圖 1.5）。
【參考文獻】

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本文編號：2873535