發(fā)布時間：2024-12-29 23:12

　　目前臨床治療癌癥的常用方式包括手術(shù)治療、放射治療及化學療法,但這三種方法對于治療晚期癌癥仍收效甚微,因此尋求新的治療手段迫在眉睫。鑒于嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞在血液瘤治療上獲得了顯著的臨床療效,近年來將這一技術(shù)應用于實體瘤治療已逐漸成為研究熱點。然而由于腫瘤免疫抑制微環(huán)境等多種因素的影響,導致CAR-T細胞在治療實體瘤過程中的療效受到限制,因此大量研究致力于對CAR各個結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化,以有效提高CAR-T細胞的抗腫瘤功效。T細胞的活化需要多種信號的參與,包括抗原激活信號（第一信號）、共刺激分子信號（第二信號）及細胞因子信號（第三信號）,但是目前臨床使用的CAR-T胞內(nèi)結(jié)構(gòu)中普遍缺乏細胞因子提供的第三信號,同時在腫瘤微環(huán)境中大多為TGF-β、IL-10等抑制信號,因此CAR結(jié)構(gòu)的優(yōu)化方向之一逐漸集中于為CAR-T細胞提供額外的激活性細胞因子信號。IL-12作為一種Th1型細胞因子,是T細胞活化、分化過程中經(jīng)典的激活性第三信號,被認為是機體抵抗腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要效應分子,已逐步嘗試應用于CAR-T細胞治療。目前已經(jīng)構(gòu)建能在局部釋放IL-12的CAR-T細胞,然而由于IL-12分泌水平...

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 課題背景
        1.1.1 癌癥治療現(xiàn)狀
        1.1.2 CAR-T細胞療法的現(xiàn)狀
        1.1.3 CAR-T治療實體瘤的挑戰(zhàn)
        1.1.4 CAR結(jié)構(gòu)針對實體瘤的優(yōu)化
        1.1.5 IL-12 的抗腫瘤機制
        1.1.6 IL-12 在CAR結(jié)構(gòu)優(yōu)化的應用
        1.1.7 IL-12R及其下游信號
    1.2 課題意義及研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞株
        2.1.2 慢病毒質(zhì)粒
        2.1.3 常用溶液及配方
        2.1.4 實驗耗材及試劑
        2.1.5 實驗主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細胞實驗
        2.2.2 構(gòu)建慢病毒表達載體pCDH-EF1α-CAR-T
        2.2.3 慢病毒包裝
        2.2.4 人外周血單核細胞分離純化及激活
        2.2.5 制備CAR-T細胞
        2.2.6 構(gòu)建PSMA+-Luciferase-PC-3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株
        2.2.7 流式細胞術(shù)
        2.2.8 CAR-T細胞體外抗腫瘤效應
        2.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法
第三章 實驗結(jié)果與分析
    3.1 構(gòu)建慢病毒表達載體pCDH-EF1α-CAR-T
        3.1.1 PSMA/CD19-CAR結(jié)構(gòu)
        3.1.2 鑒定重組慢病毒表達載體
        3.1.3 小結(jié)
    3.2 制備PSMA/CD19-CAR-T細胞
        3.2.1 慢病毒滴度檢測
        3.2.2 T細胞中CAR的轉(zhuǎn)導及表達
        3.2.3 小結(jié)
    3.3 構(gòu)建PSMA⁺-Luciferase-PC-3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株
        3.3.1 PSMA⁺-Luciferase-PC-3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的鑒定
        3.3.2 小結(jié)
    3.4 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對CAR-T活化的影響
        3.4.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段CAR-T能誘導蛋白STAT4磷酸化
        3.4.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段能促進CAR-T細胞的激活
        3.4.3 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對CAR-T細胞的增殖無顯著影響
        3.4.4 小結(jié)
    3.5 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對CAR-T分型的影響
        3.5.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對CD4⁺/CD8⁺細胞比例無顯著影響
        3.5.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段能提高T_EM細胞比例
        3.5.3 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對CAR-T細胞的耗竭無顯著影響
        3.5.4 小結(jié)
    3.6 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對CAR-T效應功能的影響
        3.6.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段可促進TNF-α 和IFN-γ 的分泌
        3.6.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段可提高CAR-T細胞的殺傷能力
        3.6.3 小結(jié)
第四章 討論與展望
參考文獻
附錄Ⅰ 縮略詞表
致謝



本文編號：4021430