發(fā)布時間：2021-03-15 09:31

  第一部分鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)血清腫瘤標(biāo)志物的篩選背景和目的鼻咽癌常是具有中國特色的腫瘤,廣西、廣東、福建等地是鼻咽癌高發(fā)區(qū),目前放射治療是鼻咽癌主要治療手段。由于鼻咽癌發(fā)病部位隱蔽,臨床癥狀不明顯,診斷時往往分期已經(jīng)較晚,給后期的治療帶來困難。即使經(jīng)過有效治療,仍然有10-15%左右的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā),復(fù)發(fā)后的再程放療,患者的治療及預(yù)后效果均不佳�，F(xiàn)鼻咽癌復(fù)發(fā)的發(fā)病機制尚未明了,目前大多數(shù)研究認為鼻咽癌的放射抗拒是鼻咽癌復(fù)發(fā)的主要原因之一,同時,目前臨床上仍沒有可用于監(jiān)測、診斷、治療鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物,本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)標(biāo)志物,構(gòu)建鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)蛋白質(zhì)表達譜,為臨床上鼻咽癌復(fù)發(fā)診療做出貢獻。方法1.采集鼻咽癌復(fù)發(fā)和正常復(fù)查隨訪組患者的血清進行研究,所有患者嚴格按照入組標(biāo)準入組。所有患者均為經(jīng)過放射治療后6個月,診斷為鼻咽癌復(fù)發(fā)或鼻咽癌正常復(fù)查隨訪病人,診斷明確后均在未予任何治療的情況下進行采血,采血后靜置離心,收集血清,分裝進入-80度冰箱進行保存。復(fù)發(fā)患者隨機抽取20個標(biāo)本隨機分入驗證A、B兩組(每組10人),正常復(fù)查隨訪患者隨機抽取20個隨機分入驗證A、B兩組(每組10人),復(fù)發(fā)組和正常復(fù)查隨訪組進行兩兩比較形成A、B兩組,經(jīng)提取蛋白和胰酶消化后,進行TMT標(biāo)記后,聯(lián)合多維固相/液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測,進行搜庫和Mascot search engine(v.2.3.0)軟件分析,得到復(fù)發(fā)與正常復(fù)查隨訪間血清差異表達蛋白,并對質(zhì)譜結(jié)果進行質(zhì)控,同時對兩次實驗進行重復(fù)性分析。對差異蛋白進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果1.血清中共鑒定出635個蛋白,其中可定量蛋白為413個,設(shè)≥1.2倍,≤0.83倍為差異倍數(shù)。兩次實驗中,在復(fù)發(fā)組均表現(xiàn)下調(diào)的為41個,均表現(xiàn)為上調(diào)的18個。并對2次獨立實驗結(jié)果的重復(fù)性進行檢驗,用散點圖和皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson's Correlation Coefficient)進行分析。結(jié)果表明2次實驗在統(tǒng)計學(xué)上一致。同時對酶解的肽段進行質(zhì)控,肽段的質(zhì)量及其分布符合質(zhì)量要求。1.2對差異蛋白進行基于GO的二級注釋分類,1.2.1上調(diào)蛋白主要參與單一結(jié)構(gòu)過程(26個蛋白),細胞生理過程(25個蛋白),應(yīng)激反應(yīng)(20個蛋白),生物調(diào)節(jié)(19個蛋白),定位作用(14個蛋白),代謝過程(13個),信號傳遞(12個),多細胞多組織的生物學(xué)過程(12個)等等。細胞構(gòu)成二級分類中,有23個分子位于胞內(nèi)區(qū),21個位于細胞器內(nèi),13個位于大分子化合物,11個位細胞膜內(nèi),10個分布在胞外區(qū)等。在分子功能分類中發(fā)揮與蛋白質(zhì)結(jié)合功能,參與分子有15個。催化活性的激活有11個分子參與,有6個分子參與了分子結(jié)構(gòu)激活,有3個參與了酶調(diào)節(jié)的激活,有1個參與電子活性的激活等。1.2.2下調(diào)蛋白中,生物學(xué)過程分類顯示:主要參與單一結(jié)構(gòu)反應(yīng)過程(40個蛋白),生理調(diào)節(jié)過程(39個蛋白)細胞生理過程(27個蛋白),應(yīng)激反應(yīng)(35個蛋白),生物調(diào)節(jié)(19個蛋白),定位作用(13個蛋白),代謝過程(29個),信號傳遞(12個),免疫反應(yīng)過程(17個),發(fā)育過程(12個),多細胞多組織的生物學(xué)過程(11個),多結(jié)構(gòu)反應(yīng)過程(8個)等等。細胞構(gòu)成分類中,有23個蛋白位于胞內(nèi)區(qū),20個位于細胞器內(nèi),13個屬于大分子化合物構(gòu)成,20個位細胞膜內(nèi),37個分布在胞外區(qū),34在細胞內(nèi)等。分子功能分類中,上調(diào)蛋白主要發(fā)揮與蛋白質(zhì)結(jié)合功能,參與蛋白有36個。催化活性的激活有9個蛋白參與,有6個參與了酶調(diào)節(jié)的激活,有5個參與運輸活性,有3個參與抗氧化作用,有3個參與分子結(jié)構(gòu)活性作用等。1.3基于GO富集分析1.3.1上調(diào)蛋白中,進行生物學(xué)過程富集度分析表明,差異蛋白主要集中在負向調(diào)節(jié)運輸活性,調(diào)節(jié)細胞周期,細胞支架的組成,調(diào)節(jié)細胞周期的進程,負向調(diào)節(jié)分子功能,細胞吞噬作用。細胞構(gòu)成主要富集在內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)腔,基質(zhì),粘著斑,細胞基質(zhì)粘連等。分子功能主要富集在與脂蛋白顆粒結(jié)合,低密度脂蛋白顆粒結(jié)合,未折疊蛋白的結(jié)合,膽固醇的結(jié)合功能等。1.3.2下調(diào)蛋白中,富集度分析發(fā)現(xiàn),差異蛋白主要參與自我保護反應(yīng),補體激活經(jīng)典途徑,免疫球蛋白調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),淋巴調(diào)節(jié)免疫力,適應(yīng)性免疫反應(yīng),對壓力的應(yīng)急反應(yīng),激活免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程;而在細胞構(gòu)成的富集度分析中,差異蛋白主要為核小體,染色質(zhì)、運輸質(zhì)子的ATP兩部分酶,運輸質(zhì)子的ATP兩部分酶化合物等;在分子功能的富集度分析中,主要參與抗原結(jié)合,運輸質(zhì)子的ATP合成酶,激活半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶抑制劑,MHC經(jīng)典途徑蛋白結(jié)合。1.4 KEGG信號通路富集分析兩次實驗中均出現(xiàn)hsa05034 Alcoholism-Homo sapiens(human),hsa04970 Salivary secretion-Homo sapiens(human),hsa05144 Malaria-Homo sapiens(human)3條通路。在KEGG數(shù)據(jù)庫,hsa05034 Alcoholism-Homo sapiens(human)豐度值最高、參與的基因數(shù)最多,最具有生物學(xué)意義。參與基因分別是CALM,H2B,H3,H4,其中基因CALM在細胞增殖、凋亡、自噬、腫瘤干細胞、DNA損傷、細胞運動、抗凋亡等作用相關(guān)。1.5結(jié)構(gòu)域的富集度分析對差異蛋白的結(jié)構(gòu)域進行富集度分析,發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要為鈣調(diào)蛋白同源結(jié)構(gòu)域、小能量結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域等。1.6聚類分析對差異蛋白進行聚類分析發(fā)現(xiàn),在第1聚類中共有19個蛋白(A2M,ACTN4,ALB,ALDOA,APP,CFD,F13A1,FN1,HRG,KNG1,PF4,PLG,PPBP,SERPINA1,SERPINE1,SERPING1,TIMP1,VWF)參與,其中,上調(diào)蛋白只有APP、SERPINE。下調(diào)蛋白包括A2M,ALB,F13A1,KNG1,SERPINA1,SERPING1。第二聚類中,包含APCS,APOA1,APOA4,CST3,F2,FGA,GSN,LTF,SERPINC1,TTR,其中,上調(diào)蛋白有APCS,FGA,SERPINC1。下調(diào)蛋白包括CST3,GSN。第三聚類中,包含APOA2,APOB,APOC3,APOE,LCAT,LPL,其中上調(diào)蛋白包含APOA2,沒有下調(diào)蛋白。1.7蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析篩選出的所有蛋白進行網(wǎng)絡(luò)互作分析,根據(jù)STRING網(wǎng)站進行結(jié)果分析,從差異蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖和網(wǎng)絡(luò)連接度看,網(wǎng)絡(luò)圖中連接程度較高的差異蛋白分別為ALB(degree=42)、APP(degree=34)、KNG1(degree=27)、F13A1(degree=25)、SERPING1(degree=25)、A2M(degree=24)、SERPINA1(degree=22)。FGA(degree=19)、SERPINC1(degree=16)、APCS(degree=10)、GSN(degree=10)、APOA2(degree=9)。結(jié)論1.本研究通過TMT聯(lián)合質(zhì)譜分析并篩選出鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)表達蛋白,初步構(gòu)建了鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)差異蛋白表達譜;2.基于質(zhì)譜結(jié)果,我們進行生物信息學(xué)分析挖掘鼻咽癌復(fù)發(fā)的可能機制,其中,我們認為CALM、A2M、APP、ALB、F13A1、KNG1、SERPINA1、SERPINE1等是鼻咽癌復(fù)發(fā)潛在的相關(guān)標(biāo)志物,補體系統(tǒng)及CALM相關(guān)因素可能是鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)的機制之一。第二部分基于ELISA的血清差異蛋白表達驗證背景及目的目前在蛋白質(zhì)組學(xué)的實驗中,質(zhì)譜得出的結(jié)果往往需要進行后期的驗證進一步證明質(zhì)譜結(jié)果的可靠性,我們重新收集血清標(biāo)本進行ELISA驗證,同時探討該蛋白在鼻咽癌復(fù)發(fā)中的可能機制。方法采集復(fù)發(fā)組50例和正常隨訪患者50例,進行后期ELISA的血清差異蛋白驗證。我們選擇CALM、A2M、APP三個蛋白進行驗證。運用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS21.0和Prism5.0進行統(tǒng)計分析。P值0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.CALM蛋白結(jié)果:由于CALM濃度不符合正態(tài)分布,我們選取中位數(shù)及四分位法對蛋白濃度進行描述,復(fù)發(fā)組和正常復(fù)查隨訪組CALM濃度中位數(shù)分別為114.2ng/l和45.10ng/l;第25%位數(shù)的濃度分別為56.08ng/l和23.08ng/l;第75%位數(shù)的濃度分別為240.1ng/l和181.8ng/l;認為兩組之間CALM表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0233),復(fù)發(fā)組表達量高于正常復(fù)查隨訪組。ROC曲線下面積為0.6931,CALM最佳界值點為48.45ng/l,靈敏度為82.8%,特異度為55%。2.APP蛋白結(jié)果:由于APP濃度不符合正態(tài)分布,我們選取中位數(shù)及四分位法對蛋白濃度進行描述,復(fù)發(fā)組和正常復(fù)查隨訪組APP濃度中位數(shù)分別為20.08ng/ml和5.502ng/ml,第25%位數(shù)的濃度分別為4.561ng/ml和4.508ng/ml。第75%位數(shù)的濃度分別為28.90ng/ml和10.26ng/ml,認為兩組之間APP表達有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.044),復(fù)發(fā)組表達量高于正常復(fù)查隨訪組。ROC曲線下面積為0.666,APP最佳界值點為16.95ng/ml,靈敏度為55.2%,特異度為90.9%。3.A2M蛋白結(jié)果:由于A2M濃度不符合正態(tài)分布,我們選取中位數(shù)及四分位法對蛋白濃度進行描述,復(fù)發(fā)組和正常復(fù)查隨訪組A2M濃度中位數(shù)分別為34.79ng/ml和75.67ng/ml,第25%位數(shù)的濃度分別為13.27ng/ml和40.03ng/ml;第75%的濃度分別為61.86ng/ml和151.92ng/ml,認為兩組之間A2M表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.177,P=0.001),不復(fù)發(fā)組表達量高于復(fù)發(fā)組。ROC曲線下面積為0.757,A2M最佳界值點為35.21ng/ml,靈敏度為56.5%,特異度為86.7%。結(jié)論經(jīng)過ELISA驗證,CALM、A2M、APP三個蛋白的表達趨勢與質(zhì)譜結(jié)果一致,這三者可能是鼻咽癌復(fù)發(fā)相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物。



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