妊娠期LPS暴露激活子代小膠質(zhì)細胞誘導大鼠孤獨癥樣行為
發(fā)布時間：2020-12-11 21:59
目的:探討妊娠期LPS誘導的ASD樣行為仔鼠的腦組織TLR4信號通路及小膠質(zhì)細胞分型變化的關(guān)系。方法:24只孕鼠隨機平分為LPS處理組及PBS對照組,分別于懷孕9.5天時給予腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS;每只100μg/kg）或等量PBS,所產(chǎn)子代大鼠即為LPS組及對照組仔鼠。三箱社交實驗、曠場實驗、嗅覺適應(yīng)/去適應(yīng)實驗、水迷宮測試檢測子代大鼠社交行為、探索行為、刻板行為及學習記憶能力。Western blotting技術(shù)檢測仔鼠成年期前額皮質(zhì)中緊密連接蛋白（Occludin和Claudin-5）、小膠質(zhì)細胞相關(guān)蛋白（IBA-1、iNOS及Arg-1）以及TLR4信號通路相關(guān)蛋白（TLR4、Phospho-NFκB p65、IKKα）表達水平變化。Real-time PCR技術(shù)檢測IBA-1、iNOS及Arg-1 mRNA表達水平變化。免疫熒光染色檢測仔鼠前額皮質(zhì)中小膠質(zhì)細胞形態(tài)學改變。ELISA試劑盒測定孕鼠血清LBP、TNFα及仔鼠腦組織TNFα、IL-10濃度。體外培養(yǎng)N9小膠質(zhì)細胞系,予以TLR4抑制劑TAK242處理后,觀察LPS誘導的N9細胞...
【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市
【文章頁數(shù)】：60 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
體內(nèi)動物實驗流程圖
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文204）加入5%BSA溶液室溫封閉1h。5）加入按比例配置好的一抗溶液4℃孵育過夜。6）回收一抗，PBS漂洗3次后加入對應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1h。7）PBS室溫避光漂洗3次后加入DAPI染色20min。8）PBS清洗3次后于暗室小心取出蓋玻片，倒扣于滴加了抗熒光淬滅劑的載玻片上，Nikon熒光顯微鏡觀察。1.3統(tǒng)計學分析利用GraphPadPrism5.統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，水迷宮潛伏期結(jié)果采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗水準α=0.05。2.結(jié)果2.1母鼠血清LBP及TNFα水平變化LBP是脂多糖結(jié)合蛋白，可介導LPS與CD14結(jié)合，激活TLR4信號通路，誘導機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，釋放TNFα、IL-6等炎癥因子。如圖2A所示，妊娠期予以LPS腹腔注射的母鼠血清LBP濃度較PBS組顯著升高（P0.01），同時伴有炎癥因子TNFα分泌增加，其差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05，圖2B），表明妊娠期LPS處理可誘導母鼠免疫激活。圖2LPS處理24h后孕鼠血清中LBP及TNFα分泌水平變化。Fig.2ThelevelsofserumLBPandTNFαinthepregnantratsfollowingLPSchallengefor24h.A.不同處理組孕鼠血清LBP濃度。B.不同處理組孕鼠血清TNFα濃度。A:TheconcentrationsofserumLBPinthepregnancyratsbetweenthePBSandLPSgroups.B:TheconcentrationsofserumTNFαinthepregnancyratsbetweenthePBSandLPSgroups.(n=6,*P<0.05,**P<0.01)
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文22圖3妊娠中期LPS處理后仔鼠成年期孤獨癥樣相關(guān)行為測試。Fig.3Theautism-likebehaviortestsoftheoffspringratstreatedbyLPSchallengeduringgestationalmiddle-period.A.仔鼠在陌生鼠箱及玩具箱中所花時間。B.仔鼠嗅不同棉簽的總時間。C.曠場實驗中仔鼠跨線次數(shù)。D.曠場實驗中仔鼠自梳理毛發(fā)時間。A:Three-chambersociabilitytest:Thespending-timeoftheoffspringratsintheboxesofstrangeratandnovelobject.B:Thecumulativetimeoftheoffspringratstosniffedcottonswabs.C:Open-fieldtest:Comparisonofthenumbersofcrossgridamongtheoffspringratsintwogroups.D:Spendingtimeofoffspringrats’selfgrooming.(n=28,**P<0.01,***P<0.001,ns:notsignificantinposthoctests)2.2.4水迷宮實驗Morris水迷宮測試主要檢測實驗動物對空間位置及定位的學習記憶能力。如圖4A所示，檢測第一天LPS組仔鼠的運動距離與PBS組相比無顯著差異，表明妊娠期腹腔注射對仔鼠的運動能力沒有影響。第2-5天定位航行實驗結(jié)果顯示，隨著訓練天數(shù)增加，兩組仔鼠找到平臺所用時間均逐漸縮短（圖4B），但自第3天開始，LPS組仔鼠的潛伏時間仍較PBS組顯著延遲，經(jīng)重復測量資料方差分析發(fā)現(xiàn)兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P0.001）。在第六天平臺探索測試中，LPS組仔鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)較PBS組有減少趨勢，但兩組間無統(tǒng)計學差異（圖4C）。提示妊娠期的LPS處理可能會降低仔鼠生后空間學習記憶功能。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]TAK-242對脂多糖誘導的膿毒癥腦病小鼠學習記憶功能障礙的改善作用[J]. 庹鵬,陳偉明,劉先保,吳亞芬,黃夢婷,陳曉彤,王壽平. 中國病理生理雜志. 2019(04)
[2]脂多糖誘導孤獨癥樣大鼠的腸道通透性及腸道黏膜免疫系統(tǒng)的變化[J]. 陳保林,何慕蘭,雷雨溪,楊亭,李廷玉,陳潔. 免疫學雜志. 2019(01)
本文編號：2911292
【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市
【文章頁數(shù)】：60 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
體內(nèi)動物實驗流程圖
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文204）加入5%BSA溶液室溫封閉1h。5）加入按比例配置好的一抗溶液4℃孵育過夜。6）回收一抗，PBS漂洗3次后加入對應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1h。7）PBS室溫避光漂洗3次后加入DAPI染色20min。8）PBS清洗3次后于暗室小心取出蓋玻片，倒扣于滴加了抗熒光淬滅劑的載玻片上，Nikon熒光顯微鏡觀察。1.3統(tǒng)計學分析利用GraphPadPrism5.統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，水迷宮潛伏期結(jié)果采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗水準α=0.05。2.結(jié)果2.1母鼠血清LBP及TNFα水平變化LBP是脂多糖結(jié)合蛋白，可介導LPS與CD14結(jié)合，激活TLR4信號通路，誘導機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，釋放TNFα、IL-6等炎癥因子。如圖2A所示，妊娠期予以LPS腹腔注射的母鼠血清LBP濃度較PBS組顯著升高（P0.01），同時伴有炎癥因子TNFα分泌增加，其差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05，圖2B），表明妊娠期LPS處理可誘導母鼠免疫激活。圖2LPS處理24h后孕鼠血清中LBP及TNFα分泌水平變化。Fig.2ThelevelsofserumLBPandTNFαinthepregnantratsfollowingLPSchallengefor24h.A.不同處理組孕鼠血清LBP濃度。B.不同處理組孕鼠血清TNFα濃度。A:TheconcentrationsofserumLBPinthepregnancyratsbetweenthePBSandLPSgroups.B:TheconcentrationsofserumTNFαinthepregnancyratsbetweenthePBSandLPSgroups.(n=6,*P<0.05,**P<0.01)
重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文22圖3妊娠中期LPS處理后仔鼠成年期孤獨癥樣相關(guān)行為測試。Fig.3Theautism-likebehaviortestsoftheoffspringratstreatedbyLPSchallengeduringgestationalmiddle-period.A.仔鼠在陌生鼠箱及玩具箱中所花時間。B.仔鼠嗅不同棉簽的總時間。C.曠場實驗中仔鼠跨線次數(shù)。D.曠場實驗中仔鼠自梳理毛發(fā)時間。A:Three-chambersociabilitytest:Thespending-timeoftheoffspringratsintheboxesofstrangeratandnovelobject.B:Thecumulativetimeoftheoffspringratstosniffedcottonswabs.C:Open-fieldtest:Comparisonofthenumbersofcrossgridamongtheoffspringratsintwogroups.D:Spendingtimeofoffspringrats’selfgrooming.(n=28,**P<0.01,***P<0.001,ns:notsignificantinposthoctests)2.2.4水迷宮實驗Morris水迷宮測試主要檢測實驗動物對空間位置及定位的學習記憶能力。如圖4A所示，檢測第一天LPS組仔鼠的運動距離與PBS組相比無顯著差異，表明妊娠期腹腔注射對仔鼠的運動能力沒有影響。第2-5天定位航行實驗結(jié)果顯示，隨著訓練天數(shù)增加，兩組仔鼠找到平臺所用時間均逐漸縮短（圖4B），但自第3天開始，LPS組仔鼠的潛伏時間仍較PBS組顯著延遲，經(jīng)重復測量資料方差分析發(fā)現(xiàn)兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P0.001）。在第六天平臺探索測試中，LPS組仔鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)較PBS組有減少趨勢，但兩組間無統(tǒng)計學差異（圖4C）。提示妊娠期的LPS處理可能會降低仔鼠生后空間學習記憶功能。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]TAK-242對脂多糖誘導的膿毒癥腦病小鼠學習記憶功能障礙的改善作用[J]. 庹鵬,陳偉明,劉先保,吳亞芬,黃夢婷,陳曉彤,王壽平. 中國病理生理雜志. 2019(04)
[2]脂多糖誘導孤獨癥樣大鼠的腸道通透性及腸道黏膜免疫系統(tǒng)的變化[J]. 陳保林,何慕蘭,雷雨溪,楊亭,李廷玉,陳潔. 免疫學雜志. 2019(01)
本文編號：2911292
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