發(fā)布時(shí)間：2020-12-11 21:59

　　目的:探討妊娠期LPS誘導(dǎo)的ASD樣行為仔鼠的腦組織TLR4信號(hào)通路及小膠質(zhì)細(xì)胞分型變化的關(guān)系。方法:24只孕鼠隨機(jī)平分為L(zhǎng)PS處理組及PBS對(duì)照組,分別于懷孕9.5天時(shí)給予腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS;每只100μg/kg）或等量PBS,所產(chǎn)子代大鼠即為L(zhǎng)PS組及對(duì)照組仔鼠。三箱社交實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、嗅覺(jué)適應(yīng)/去適應(yīng)實(shí)驗(yàn)、水迷宮測(cè)試檢測(cè)子代大鼠社交行為、探索行為、刻板行為及學(xué)習(xí)記憶能力。Western blotting技術(shù)檢測(cè)仔鼠成年期前額皮質(zhì)中緊密連接蛋白（Occludin和Claudin-5）、小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白（IBA-1、iNOS及Arg-1）以及TLR4信號(hào)通路相關(guān)蛋白（TLR4、Phospho-NFκB p65、IKKα）表達(dá)水平變化。Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)IBA-1、iNOS及Arg-1 mRNA表達(dá)水平變化。免疫熒光染色檢測(cè)仔鼠前額皮質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。ELISA試劑盒測(cè)定孕鼠血清LBP、TNFα及仔鼠腦組織TNFα、IL-10濃度。體外培養(yǎng)N9小膠質(zhì)細(xì)胞系,予以TLR4抑制劑TAK242處理后,觀察LPS誘導(dǎo)的N9細(xì)胞... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程圖

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文204）加入5%BSA溶液室溫封閉1h。5）加入按比例配置好的一抗溶液4℃孵育過(guò)夜。6）回收一抗，PBS漂洗3次后加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1h。7）PBS室溫避光漂洗3次后加入DAPI染色20min。8）PBS清洗3次后于暗室小心取出蓋玻片，倒扣于滴加了抗熒光淬滅劑的載玻片上，Nikon熒光顯微鏡觀察。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用GraphPadPrism5.統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，水迷宮潛伏期結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2.結(jié)果2.1母鼠血清LBP及TNFα水平變化LBP是脂多糖結(jié)合蛋白，可介導(dǎo)LPS與CD14結(jié)合，激活TLR4信號(hào)通路，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，釋放TNFα、IL-6等炎癥因子。如圖2A所示，妊娠期予以LPS腹腔注射的母鼠血清LBP濃度較PBS組顯著升高（P0.01），同時(shí)伴有炎癥因子TNFα分泌增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05，圖2B），表明妊娠期LPS處理可誘導(dǎo)母鼠免疫激活。圖2LPS處理24h后孕鼠血清中LBP及TNFα分泌水平變化。Fig.2ThelevelsofserumLBPandTNFαinthepregnantratsfollowingLPSchallengefor24h.A.不同處理組孕鼠血清LBP濃度。B.不同處理組孕鼠血清TNFα濃度。A:TheconcentrationsofserumLBPinthepregnancyratsbetweenthePBSandLPSgroups.B:TheconcentrationsofserumTNFαinthepregnancyratsbetweenthePBSandLPSgroups.(n=6,*P<0.05,**P<0.01)

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文22圖3妊娠中期LPS處理后仔鼠成年期孤獨(dú)癥樣相關(guān)行為測(cè)試。Fig.3Theautism-likebehaviortestsoftheoffspringratstreatedbyLPSchallengeduringgestationalmiddle-period.A.仔鼠在陌生鼠箱及玩具箱中所花時(shí)間。B.仔鼠嗅不同棉簽的總時(shí)間。C.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中仔鼠跨線次數(shù)。D.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中仔鼠自梳理毛發(fā)時(shí)間。A:Three-chambersociabilitytest:Thespending-timeoftheoffspringratsintheboxesofstrangeratandnovelobject.B:Thecumulativetimeoftheoffspringratstosniffedcottonswabs.C:Open-fieldtest:Comparisonofthenumbersofcrossgridamongtheoffspringratsintwogroups.D:Spendingtimeofoffspringrats’selfgrooming.(n=28,**P<0.01,***P<0.001,ns:notsignificantinposthoctests)2.2.4水迷宮實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮測(cè)試主要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置及定位的學(xué)習(xí)記憶能力。如圖4A所示，檢測(cè)第一天LPS組仔鼠的運(yùn)動(dòng)距離與PBS組相比無(wú)顯著差異，表明妊娠期腹腔注射對(duì)仔鼠的運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有影響。第2-5天定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著訓(xùn)練天數(shù)增加，兩組仔鼠找到平臺(tái)所用時(shí)間均逐漸縮短（圖4B），但自第3天開始，LPS組仔鼠的潛伏時(shí)間仍較PBS組顯著延遲，經(jīng)重復(fù)測(cè)量資料方差分析發(fā)現(xiàn)兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.001）。在第六天平臺(tái)探索測(cè)試中，LPS組仔鼠穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)較PBS組有減少趨勢(shì)，但兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4C）。提示妊娠期的LPS處理可能會(huì)降低仔鼠生后空間學(xué)習(xí)記憶功能。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]TAK-242對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥腦病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的改善作用[J]. 庹鵬,陳偉明,劉先保,吳亞芬,黃夢(mèng)婷,陳曉彤,王壽平.  中國(guó)病理生理雜志. 2019(04)
[2]脂多糖誘導(dǎo)孤獨(dú)癥樣大鼠的腸道通透性及腸道黏膜免疫系統(tǒng)的變化[J]. 陳保林,何慕蘭,雷雨溪,楊亭,李廷玉,陳潔.  免疫學(xué)雜志. 2019(01)



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