漸進(jìn)性梯度孔徑支架聯(lián)合BMP2-ADSCs及自體PRP凝膠修復(fù)骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究
發(fā)布時間：2020-12-07 22:51
目的:在已成功制備梯度孔徑SF-CS-n HA骨軟骨支架的基礎(chǔ)上,通過復(fù)合BMP2-ADSCs和自體PRP凝膠構(gòu)建骨軟骨移植體修復(fù)比格犬膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損,完成移植體總體性能的檢測,以期為修復(fù)骨軟骨缺損提供一種更加合適的骨軟骨移植體。方法:采用Ⅰ型膠原酶消化的方法提取比格犬ADSCs,培養(yǎng)至第3代,通過CCK-8法檢測ADSCs增殖活性,通過免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)鑒定ADSCs表面抗原的表型。探索LV-BMP2-GDF轉(zhuǎn)染ADSCs的最佳MOI值,對BMP2-ADSCs進(jìn)行傳代培養(yǎng)后通過RT-PCR檢測種子細(xì)胞中BMP-2基因水平。對比格犬靜脈血通過離心的方法制備PRP,利用牛凝血酶激活PRP為凝膠狀態(tài),利用ELISA檢測PRP凝膠中TGF-β1和PDGF-BB釋放水平。利用梯度孔徑SF-CS-n HA骨軟骨支架、BMP2-ADSCs、自體PRP凝膠構(gòu)建骨軟骨移植體,將移植體植入比格犬膝關(guān)節(jié)股骨遠(yuǎn)端滑車中央骨軟骨缺損處。將24只比格犬隨機(jī)分為A組（細(xì)胞-PRP-支架組）、B組（PRP-支架組）、C組（單純支架組）和D組（空白對照組）,A組:BMP2-ADSCs+PRP凝膠+支架;B組:PR...
【文章來源】：遵義醫(yī)科大學(xué)貴州省
【文章頁數(shù)】：64 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
%濃度SF-CS-nHA梯度孔徑支架及支架掃描電鏡
遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文熊坤17圖2比格犬膝關(guān)節(jié)全層骨軟骨缺損（直徑：4mm，深度：5mm）及移植體植入后狀態(tài)Fig.2Beagledogfullthicknessosteochondraldefect(diameter:4mm,depth:5mm)andpost-implantationstate1.2.5術(shù)后各項(xiàng)指標(biāo)檢測（1）大體觀察注射鹽酸氯胺酮處死各組術(shù)后2月、4月比格犬。沿先前手術(shù)切口逐層剖開膝關(guān)節(jié)，暴露骨軟骨缺損模型處。觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)是否存在感染、組織粘連。觀察骨軟骨缺損處的修復(fù)情況，如質(zhì)地、顏色以及與周圍正常軟骨組織的整合情況。截取骨軟骨缺損修復(fù)模型及周圍正常骨軟骨，4%多聚甲醛固定1-2d，加入適量EDTA脫鈣液對樣本進(jìn)行脫鈣，每3天更換一次脫鈣溶液，脫鈣兩周左右樣本變軟。（2）影像學(xué)觀察骨質(zhì)再生在遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（遵義市第一人民醫(yī)院）影像科對A組（細(xì)胞-PRP-支架組）進(jìn)行術(shù)前、術(shù)后、術(shù)后2月、術(shù)后4月進(jìn)行X射線拍照，分析骨軟骨缺損處骨質(zhì)的修復(fù)效果。（3）移植體中BMP2-ADSCs存活情況對2個月的實(shí)驗(yàn)組比格犬行1％戊巴比妥鈉（1mL/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定，備皮、碘伏消毒和鋪巾。沿先前的手術(shù)切口膝關(guān)節(jié)外側(cè)手術(shù)切口，逐層剖開組織至關(guān)節(jié)腔，找到骨軟骨缺損修復(fù)處，用5mm環(huán)鉆將骨軟骨缺損修復(fù)處的骨軟骨取出，縫合比格犬膝關(guān)節(jié)切口。將取出后的樣本進(jìn)行涂片后迅速轉(zhuǎn)移至暗室中，用
遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文熊坤202結(jié)果2.1ADSCs的提娶培養(yǎng)、鑒定和增殖結(jié)果2.1.1ADSCs的提取和培養(yǎng)比格犬脂肪組織剪碎后加入0.1%Ⅰ型膠原酶消化30min，可見脂肪組織幾乎被消化成糊狀時既消化完成，見圖3。加入完全培養(yǎng)基終止消化，無菌紗網(wǎng)過濾，離心，培養(yǎng)基重懸后種入細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。1d后可見培養(yǎng)瓶底部有單個的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)貼壁，培養(yǎng)液中有較多的脂肪亮點(diǎn)。培養(yǎng)3d后，貼壁細(xì)胞較第1d增多，細(xì)胞團(tuán)周圍細(xì)胞分裂活躍，單個細(xì)胞多呈梭形、紡錘形或三角形。培養(yǎng)6天后，細(xì)胞基本鋪滿瓶底面積80%以上，細(xì)胞形態(tài)基本一致。傳代至第2代和第3代時，細(xì)胞呈漩渦狀樣或魚群樣生長，生長活躍，細(xì)胞形態(tài)均一，梭形和紡錘形明顯，見圖4。圖3脂肪粒用0.1%Ⅰ型膠原酶消化30min后的狀態(tài)Fig.3Thestateoffatgranulesafterdigestionwith0.1%collagenasetypeIfor30minutes
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增與鑒定[J]. 馬晨,李曉國,徐明均,馬曉娜,馬曉薇. 中國組織工程研究. 2019(33)
[2]絲素蛋白殼聚糖和納米羥基磷灰石制備骨軟骨梯度孔徑支架初探[J]. 肖紅利,黃文良,熊坤,李茂倫,陳禺,鄧江. 中華老年醫(yī)學(xué)雜志. 2018 (07)
[3]基因重組腺病毒載體與慢病毒載體轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的對比[J]. 李詩鵬,李強(qiáng),石正松,蔡偉良,寧寅寬,陶旋. 中國組織工程研究. 2017(09)
[4]富血小板血漿制備方法穩(wěn)定性的研究[J]. 潘紅娟,王雅麗,呂爽,劉鐵梅. 中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué). 2016(06)
[5]絲素蛋白/殼聚糖/納米羥基磷灰石骨組織工程支架材料的體外細(xì)胞毒性評價[J]. 馬立坤,葉鵬,鄧江,黃文良,田仁元,呂雪峰. 西部醫(yī)學(xué). 2014(08)
[6]腺病毒介導(dǎo)BMP-2和EGFP基因轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及種植脫鈣骨的體外觀察[J]. 陳佳濱,李強(qiáng),茹嘉,武成聰,寧寅寬,蔡偉良. 中國骨質(zhì)疏松雜志. 2014(08)
[7]兔富血小板血漿制備及其活性分析[J]. 王鵬飛,時長江,王玉亮,姜文學(xué). 中國組織工程研究. 2013(08)
[8]富血小板血漿臨床應(yīng)用及其生物材料性能[J]. 李明,張長青. 中國組織工程研究與臨床康復(fù). 2011(08)
[9]BMP2-EGFP融合蛋白的構(gòu)建及其生物活性[J]. 張銀剛,郭雄,師常宏,鄒愛民,許鵬. 中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2005(01)
碩士論文
[1]漸進(jìn)性梯度孔徑骨軟骨支架的制備及性能研究[D]. 肖紅利.遵義醫(yī)科大學(xué) 2019
[2]自體與異體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠急性心肌梗死的比較研究[D]. 汪兆艷.軍事科學(xué)院 2018
本文編號：2904020
【文章來源】：遵義醫(yī)科大學(xué)貴州省
【文章頁數(shù)】：64 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
%濃度SF-CS-nHA梯度孔徑支架及支架掃描電鏡
遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文熊坤17圖2比格犬膝關(guān)節(jié)全層骨軟骨缺損（直徑：4mm，深度：5mm）及移植體植入后狀態(tài)Fig.2Beagledogfullthicknessosteochondraldefect(diameter:4mm,depth:5mm)andpost-implantationstate1.2.5術(shù)后各項(xiàng)指標(biāo)檢測（1）大體觀察注射鹽酸氯胺酮處死各組術(shù)后2月、4月比格犬。沿先前手術(shù)切口逐層剖開膝關(guān)節(jié)，暴露骨軟骨缺損模型處。觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)是否存在感染、組織粘連。觀察骨軟骨缺損處的修復(fù)情況，如質(zhì)地、顏色以及與周圍正常軟骨組織的整合情況。截取骨軟骨缺損修復(fù)模型及周圍正常骨軟骨，4%多聚甲醛固定1-2d，加入適量EDTA脫鈣液對樣本進(jìn)行脫鈣，每3天更換一次脫鈣溶液，脫鈣兩周左右樣本變軟。（2）影像學(xué)觀察骨質(zhì)再生在遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（遵義市第一人民醫(yī)院）影像科對A組（細(xì)胞-PRP-支架組）進(jìn)行術(shù)前、術(shù)后、術(shù)后2月、術(shù)后4月進(jìn)行X射線拍照，分析骨軟骨缺損處骨質(zhì)的修復(fù)效果。（3）移植體中BMP2-ADSCs存活情況對2個月的實(shí)驗(yàn)組比格犬行1％戊巴比妥鈉（1mL/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定，備皮、碘伏消毒和鋪巾。沿先前的手術(shù)切口膝關(guān)節(jié)外側(cè)手術(shù)切口，逐層剖開組織至關(guān)節(jié)腔，找到骨軟骨缺損修復(fù)處，用5mm環(huán)鉆將骨軟骨缺損修復(fù)處的骨軟骨取出，縫合比格犬膝關(guān)節(jié)切口。將取出后的樣本進(jìn)行涂片后迅速轉(zhuǎn)移至暗室中，用
遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文熊坤202結(jié)果2.1ADSCs的提娶培養(yǎng)、鑒定和增殖結(jié)果2.1.1ADSCs的提取和培養(yǎng)比格犬脂肪組織剪碎后加入0.1%Ⅰ型膠原酶消化30min，可見脂肪組織幾乎被消化成糊狀時既消化完成，見圖3。加入完全培養(yǎng)基終止消化，無菌紗網(wǎng)過濾，離心，培養(yǎng)基重懸后種入細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。1d后可見培養(yǎng)瓶底部有單個的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)貼壁，培養(yǎng)液中有較多的脂肪亮點(diǎn)。培養(yǎng)3d后，貼壁細(xì)胞較第1d增多，細(xì)胞團(tuán)周圍細(xì)胞分裂活躍，單個細(xì)胞多呈梭形、紡錘形或三角形。培養(yǎng)6天后，細(xì)胞基本鋪滿瓶底面積80%以上，細(xì)胞形態(tài)基本一致。傳代至第2代和第3代時，細(xì)胞呈漩渦狀樣或魚群樣生長，生長活躍，細(xì)胞形態(tài)均一，梭形和紡錘形明顯，見圖4。圖3脂肪粒用0.1%Ⅰ型膠原酶消化30min后的狀態(tài)Fig.3Thestateoffatgranulesafterdigestionwith0.1%collagenasetypeIfor30minutes
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增與鑒定[J]. 馬晨,李曉國,徐明均,馬曉娜,馬曉薇. 中國組織工程研究. 2019(33)
[2]絲素蛋白殼聚糖和納米羥基磷灰石制備骨軟骨梯度孔徑支架初探[J]. 肖紅利,黃文良,熊坤,李茂倫,陳禺,鄧江. 中華老年醫(yī)學(xué)雜志. 2018 (07)
[3]基因重組腺病毒載體與慢病毒載體轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的對比[J]. 李詩鵬,李強(qiáng),石正松,蔡偉良,寧寅寬,陶旋. 中國組織工程研究. 2017(09)
[4]富血小板血漿制備方法穩(wěn)定性的研究[J]. 潘紅娟,王雅麗,呂爽,劉鐵梅. 中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué). 2016(06)
[5]絲素蛋白/殼聚糖/納米羥基磷灰石骨組織工程支架材料的體外細(xì)胞毒性評價[J]. 馬立坤,葉鵬,鄧江,黃文良,田仁元,呂雪峰. 西部醫(yī)學(xué). 2014(08)
[6]腺病毒介導(dǎo)BMP-2和EGFP基因轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及種植脫鈣骨的體外觀察[J]. 陳佳濱,李強(qiáng),茹嘉,武成聰,寧寅寬,蔡偉良. 中國骨質(zhì)疏松雜志. 2014(08)
[7]兔富血小板血漿制備及其活性分析[J]. 王鵬飛,時長江,王玉亮,姜文學(xué). 中國組織工程研究. 2013(08)
[8]富血小板血漿臨床應(yīng)用及其生物材料性能[J]. 李明,張長青. 中國組織工程研究與臨床康復(fù). 2011(08)
[9]BMP2-EGFP融合蛋白的構(gòu)建及其生物活性[J]. 張銀剛,郭雄,師常宏,鄒愛民,許鵬. 中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2005(01)
碩士論文
[1]漸進(jìn)性梯度孔徑骨軟骨支架的制備及性能研究[D]. 肖紅利.遵義醫(yī)科大學(xué) 2019
[2]自體與異體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠急性心肌梗死的比較研究[D]. 汪兆艷.軍事科學(xué)院 2018
本文編號：2904020
本文鏈接：http://www.lk138.cn/shoufeilunwen/mpalunwen/2904020.html
最近更新
教材專著
