發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 13:34

　　 著床前胚胎發(fā)育是一個(gè)受到精密調(diào)控的發(fā)育過(guò)程。研究著床前胚胎發(fā)育機(jī)制對(duì)于生殖生物學(xué)及再生醫(yī)學(xué)都有深遠(yuǎn)意義,因此著床前胚胎發(fā)育一直倍受矚目。在著床前胚胎發(fā)育過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列特異事件,如合子基因激活(zygote genome activation,ZGA)。長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNAs,lnc RNAs)參與調(diào)控已經(jīng)成為新的生物學(xué)研究領(lǐng)域。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步,大量lnc RNA在早期胚胎中被發(fā)現(xiàn),但是,目前還沒(méi)有研究能夠回答有沒(méi)有一些lnc RNA會(huì)參與到著床前胚胎發(fā)育調(diào)控過(guò)程中,如果有,這些lnc RNA以怎樣的機(jī)制參與調(diào)控。內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(Endogenous retroviruses,ERVs)是進(jìn)化上內(nèi)化于高等有顎脊椎動(dòng)物基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列元件。內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序列廣泛分布,占人類基因組的8%,占小鼠基因組的10%。內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序列曾一度被認(rèn)為是垃圾DNA,但越來(lái)越多的證據(jù)表明,內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序列參與了多方面生物學(xué)調(diào)控。病毒序列編碼的蛋白質(zhì)可參與宿主細(xì)胞功能。有些內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒尚保持轉(zhuǎn)座能力,對(duì)于生殖細(xì)胞內(nèi)基因重組等進(jìn)化相關(guān)事件起到關(guān)鍵作用。我們?cè)缇椭�道小鼠ERV在著床前胚胎中轉(zhuǎn)錄,但具體發(fā)揮什么功能尚不清楚。是否存在ERV相關(guān)的lnc RNA參與著床前胚胎發(fā)育調(diào)控值得研究。我們針對(duì)ERVs的精心設(shè)計(jì)了半隨機(jī)引物,通過(guò)半隨機(jī)擴(kuò)增,從小鼠早期胚胎各時(shí)期篩選m ERV相關(guān)未知轉(zhuǎn)錄本,經(jīng)過(guò)分子克隆技術(shù)(鏈特異性PCR及RACE等)獲得至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng),分析其是否為lnc RNA。對(duì)明確是lnc RNA的未知轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析、表達(dá)模式分析以及功能研究。具體結(jié)果如下:通過(guò)PCR及測(cè)序結(jié)果的UCSC比對(duì)分析,我們鑒定出了36個(gè)新轉(zhuǎn)錄本。大部分新轉(zhuǎn)錄本(28/36)是ERV相關(guān)的,與預(yù)期相符。其中23個(gè)是GLN相關(guān)的,5個(gè)是Mu ERVL相關(guān)的;通過(guò)鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄PCR以及RACE技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)lnc-GET是GLN,MERVL及MERVK相關(guān)的、可剪切的、有多聚腺苷酸尾的、含兩種剪切突變體的RNA;Dyei是由GLN的LTR轉(zhuǎn)錄的、長(zhǎng)665 nt的、GLN相關(guān)的、含3個(gè)外顯子的RNA。亞細(xì)胞定位分析表明lnc-GET和Dyei定位于核,且主要是染色質(zhì)定位的,因此lnc-GET和Dyei是非編碼的。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及mi RNA反義Northern印記實(shí)驗(yàn)排除了lnc-GET和Dyei是mi RNA前體的可能性。Taq Man定量PCR實(shí)驗(yàn)及RNA-FISH實(shí)驗(yàn)表明,lnc-GET是2-至4-細(xì)胞胚胎特異表達(dá)的,Dyei是4-細(xì)胞胚胎特異表達(dá)的;干擾lnc-GET導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯于2-細(xì)胞時(shí)期,而干擾Dyei不影響著床前胚胎發(fā)育。干擾lnc-GET的胚胎在培養(yǎng)液中能維持2-細(xì)胞狀態(tài)至少4天而不凋亡。干擾lnc-GET阻滯的胚胎呈Brd U強(qiáng)陽(yáng)性、CAF1陰性,表明阻滯于G2時(shí)期,呈H3第10位精氨酸磷酸化(H3S10ph)染色陽(yáng)性,表明阻滯于G2晚期。γH2A.X免疫熒光染色呈陰性,表明阻滯不是由于DNA損傷導(dǎo)致的。阻滯胚胎內(nèi),G2/M轉(zhuǎn)換相關(guān)關(guān)鍵細(xì)胞周期蛋白依賴的蛋白酶CDK1以及母源蛋白OCT4和CDX2沒(méi)有顯著變化;主要合子基因激活(major ZGA)起始不受影響。我們還發(fā)現(xiàn)臂間衛(wèi)星序列的正義鏈及反義鏈轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平?jīng)]有變化,DNA-FISH結(jié)果顯示臂間環(huán)已經(jīng)變成了染色中心;通過(guò)低起始量RNA-seq我們比較了注射對(duì)照鎖核酸(LNA)的對(duì)照晚期2-細(xì)胞胚胎(2225枚)與干擾lnc-GET的阻滯2-細(xì)胞胚胎(2042枚)在major ZGA時(shí)期的基因表達(dá)情況�？傮w上講,在干擾lnc-GET的阻滯2-細(xì)胞胚胎中有723個(gè)基因上調(diào),521個(gè)基因下調(diào)(FDR≤0.0001,RPKM≥1,2倍以上),多達(dá)11060個(gè)基因發(fā)生了異常剪切,表明干擾lnc-GET造成了major ZGA嚴(yán)重異常。KEGG通路分析表明干擾lnc-GET主要影響了MAPK信號(hào)通路,表現(xiàn)在ERK1/2-MAPK及LNK/p38-MAPK通路的核心因子表達(dá)量顯著下降。異常剪切基因的GO-BP分析結(jié)果表明發(fā)生異常剪切的基因主要聚類于細(xì)胞周期相關(guān)基因(主要是M周期相關(guān)的)。表明干擾lnc-GET造成的阻滯可能是影響了細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及可變剪切導(dǎo)致的;我們通過(guò)pulldown-質(zhì)譜來(lái)檢測(cè)lnc-GET結(jié)合的蛋白,鑒定出了hn RNP U、FUBP1、DAZAP1及ILF2。這4個(gè)蛋白定位于晚期2-細(xì)胞及早期4-細(xì)胞核內(nèi),說(shuō)明是與lnc-GET共定位的。這4個(gè)蛋白都是剪切復(fù)合體組分,3個(gè)是轉(zhuǎn)錄因子,表明pulldown-質(zhì)譜結(jié)果與RNA-seq結(jié)果相符:lnc-GET可能參與了轉(zhuǎn)錄及剪切調(diào)控;無(wú)論通過(guò)Wilcoxon rank sum檢驗(yàn)結(jié)合Benjamin多重檢驗(yàn),還是Wilcoxon rank single檢驗(yàn)(p2.2×10-16)均發(fā)現(xiàn)DEGs傾向于富集在其相關(guān)的GLN,Mu ERVL及ERVK的LTR(GLK-LTRs)附近。因此lnc-GET可能是通過(guò)介導(dǎo)GLK-LTR的順式調(diào)控元件的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q132
【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 長(zhǎng)非編碼RNA研究現(xiàn)狀
        1.1.1 lnc RNA與X染色體失活
        1.1.2 lnc RNA與基因印記
        1.1.3 lnc RNA與Hox基因簇調(diào)控
        1.1.4 lnc RNA與卵裂期染色中心形成
        1.1.5 lnc RNA與神經(jīng)命運(yùn)特化
        1.1.6 lnc RNA與ES多能性維持及分化
        1.1.7 lnc RNA與疾病
        1.1.8 lnc RNA與凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控
        1.1.9 lnc RNA與免疫
        1.1.10 lnc RNA與線粒體調(diào)節(jié)
    1.2 lnc RNA調(diào)控的機(jī)制
        1.2.1 lnc RNA參與轉(zhuǎn)錄前調(diào)控
        1.2.2 lnc RNA參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        1.2.3 lnc RNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控
    1.3 內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒
        1.3.1 內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒元件作為啟動(dòng)子或增強(qiáng)子或poly A
        1.3.2 內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒元件表達(dá)病毒蛋白參與細(xì)胞功能
        1.3.3 內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)轉(zhuǎn)錄本
    1.4 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.1.3 主要試劑及試劑盒
        2.1.4 主要抗體
        2.1.5 常用試劑及配制
        2.1.6 主要的生物分析軟件及網(wǎng)站
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 半隨機(jī)擴(kuò)增篩選ERV相關(guān)lnc RNA
        2.2.2 鏈特異性PCR
        2.2.3 亞細(xì)胞定位分析
        2.2.4 表達(dá)模式分析
        2.2.5 5'RACE
        2.2.6 3'RACE
        2.2.7 RNA-FISH
        2.2.8 DNA-FISH
        2.2.9 胚胎Brd U免疫熒光檢測(cè)
        2.2.10 胚胎EU檢測(cè)
        2.2.11 mi RNA reverse Northern Blot
        2.2.12 RNA pulldown
        2.2.14 RNA干擾
        2.2.15 低起始量RNA-seq
        2.2.16 選擇性剪切驗(yàn)證
3 結(jié)果與分析
    3.1 篩選出36個(gè)未知轉(zhuǎn)錄本
        3.1.1 半隨機(jī)擴(kuò)增
        3.1.2 UCSC比對(duì)篩選位置轉(zhuǎn)錄本
        3.1.3 部分新轉(zhuǎn)錄本在著床前胚胎表達(dá)模式分析
    3.2 lnc-GET及Dyei是lnc RNA
        3.2.1 lnc-GET及Dyei的全長(zhǎng)分析
        3.2.2 lnc-GET及Dyei的蛋白編碼能力分析
        3.2.3 lnc-GET及Dyei不是pri-mi RNA
    3.3 lnc-GET及Dyei的表達(dá)模式分析
    3.4 干擾Dyei不影響小鼠著床前胚胎發(fā)育
    3.5 干擾lnc-GET導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育阻滯于 2-細(xì)胞晚期G2期
    3.6 lnc-GET干擾阻滯 2-細(xì)胞的特征
    3.7 lnc-GET與ILF2、hn RNP U、DAZAP1、FUBP1互作
    3.8 lnc-GET可能通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄及RNA剪切實(shí)現(xiàn)其功能
4 討論
    4.1 lnc RNA的半隨機(jī)擴(kuò)增篩選
    4.2 ERV在著床前胚胎內(nèi)的功能
    4.3 lnc-GET的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制類似增強(qiáng)字樣lnc RNA
    4.4 lnc-GET與CARM1的互作
    4.5 lnc-GET與選擇性剪切
    4.6 lnc-GET的過(guò)表達(dá)
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文

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本文編號(hào)：2891490