發(fā)布時間：2018-08-26 11:08

【摘要】：隨著人們物質生活水平的提高以及體育活動的減少,導致肥胖及其相關代謝疾病的發(fā)病率顯著增加,繼而損傷機體的健康。所以,近年來尋求一種綠色高效的減肥手段一貫被研究者所重視。然而膳食油脂作為引起體內脂質沉淀的主要原因,對機體的生物學作用和內在分子機制不甚清楚。本論文采用組合生物學技術,對非酒精性脂肪肝病(NAFLD)細胞模型的建立、脂肪酸(FA)對該模型細胞凋亡、氧化壓力、免疫調控和脂質代謝的分子作用機制進行了非常全面的探討。采用MTT細胞活性檢測法、LDH細胞壞死檢測法、Hoechst 33342染色對細胞凋亡測定法、油紅O染色法和甘油三酯(TG)定量測定法、掃描電鏡對細胞膜損傷程度檢測法對建立符合人類自然病規(guī)律的NAFLD模型(最大脂質沉淀和較低的細胞毒性)的條件進行了探索。采用檢測細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞儀法(FCM)和Hoechst33342/PI熒光顯微鏡法、細胞的抗氧化及氧化壓力的酶標儀測定法、差異蛋白測定的蛋白組學法、WB以及ELISA結合熒光定量PCR技術考察了免疫因子的表達,研究膳食中FA的種類對人肝脂變細胞凋亡、免疫調控和氧化壓力的影響,探究促進NAFLD到進一步肝損傷的機制。采用MTT細胞活性檢測法、油紅O染色和TG定性定量測定法以及脂代謝基因型熒光定量PCR、ELISA與WB相結合的方法,對中碳鏈脂肪酸(MCFA)對NAFLD細胞脂滴的聚集及相關脂代謝的分子作用機制進行了全面的探究。本研究的主要結果總結如下:第1章緒論部分對MCFA的生物學特性和NAFLD的研究進展分別做了綜述,并對引起NAFLD的分子作用機制作出了展望。FA生物學特性,包括FA的代謝特點、生理功能、安全性和潛在的局限性的研究進展。NAFLD研究部分包括該病發(fā)病的原因、模型的建立、引起的細胞凋亡、氧化壓力、免疫調控和相關脂代謝信號通路的研究進展。第2章對建立符合人類自然疾病規(guī)律的NAFLD模型的最適條件進行了探索。通過MTT和LDH相互驗證的實驗方法考察混合FA(油酸:棕櫚酸=2:1)和單一FA(油酸)對L02和HepG2兩種肝細胞的增殖與凋亡的影響,結果發(fā)現(xiàn)FA對細胞的毒性均產生濃度和時間依賴性,當濃度低于400μM時,不會對細胞的活性存在影響,且LO2細胞對FA的毒性影響較HepG2肝細胞更加敏感。進一步通過Hoechst染色法對細胞凋亡的檢測結果說明細胞凋亡的程度與FA的濃度呈正相關,在濃度小于400 μM時,與對照組相比均不會明顯引起細胞的凋亡;濃度升高到800 μM時,均可引起細胞的毒性。通過油紅O染色定性觀察細胞內的脂滴及細胞的形態(tài),磷酸甘油氧化酶法定量對胞里TG含量的測定,結果表明FA混合物相對于單一 FA更適合用來建立肝脂變細胞模型;當混合FA與LO2細胞孵育時間為24 h,作用終濃度為200μM 時,到達最高的脂質沉淀且造成的肝細胞慢性損傷和NAFLD的慢性肝脂肪變接近。第3章通過研究膳食中FA的種類對人肝脂變細胞凋亡和氧化壓力的影響,探究促進NAFLD到進一步肝損傷的機制。通過對細胞凋亡分析表明:同LCFA對比,MCFA能顯著降低早、中、晚期凋亡細胞和壞死細胞的百分比,同時抑制Caspase3和Caspase9酶的活性。氧化分析結果表明:采用蛋白雙向電泳及二級質譜方法研究發(fā)現(xiàn)LCFA能抑制抗氧化酶的產生;進一步通過對SOD、MDA、GSH和ROS的測定也發(fā)現(xiàn)MCFA不會產生氧化壓力,而LCFA會對細胞產生氧化壓力。本章結果表明:通過改變膳食中FA的種類可抑制肝脂變細胞的進一步損傷,不會促進該病的進一步惡化。第4章通過檢測膳食中FA的種類對人肝脂變細胞免疫調控的影響,探究促進NAFLD到進一步肝炎的發(fā)病機制。通過對NO和iNOS測定分析表明:MCFA組與NR組對比不會引起NO和iNOS水平增加,LCFA亦不會引起NO和iNOS的顯著增加。細胞免疫分析表明:MCFA不能促進IL-6、IL-1-β和TNF-α經典免疫因子的分泌,而LCFA具有類似LPS的作用,能顯著提高上述免疫因子的產生。本章結果表明:FA引起肝脂變細胞的凋亡不依賴于NO和iNOS途徑,且LCFA能強烈引起細胞的免疫應答,攝入含MCFA的油脂對NAFLD的進一步惡化為NASH起著積極的作用。第5章脂質在肝臟中過量沉積會引起肝細胞功能的紊亂,進而促進脂肪肝的形成危害機體的健康,但引起脂滴在肝細胞里聚集的機制仍未能得到明確的解釋。本章探究MCFA對NAFLD細胞中脂質代謝的影響,試圖尋找日常飲食中脂肪的替代品。油紅O染色和TG檢測實驗暗示:與LCFA(油酸,C18:1)對比,MCFA可顯著降低肝脂變LO2細胞內脂滴的積累,具有類似吉非羅齊藥物的降脂效果。RT-PCR和WB的研究結果表明:MCFA通過下調LPL、FAS、ACC、LXR-α、CD36和SREBP-1脂肪生成基因的在肝脂變細胞內的表達,同時上調ATGL和HSL加速脂肪氧化分解基因的表達,從而使細胞內TG的聚集得到改善,最終使肝細胞的脂肪變程度得到緩和。第6章結論與展望部分對MCFA對NAFLD細胞模型細胞凋亡、抗氧化體系、免疫調控和脂質代謝的分子作用機制進行了歸納,對后續(xù)研究工作進行了展望。綜上所述,膳食中油脂與NAFLD細胞模型的相互用的分子機制仍需進一步探究。本文從NAFLD細胞模型的建立,以及MCFA對該模型中細胞的活性與凋亡、抗氧化體系、脂質沉淀和免疫反應的生物學作用,并從細胞和分子水平探討了 MCFA對該模型脂質代謝和免疫調控相關機制。本論文對肥胖人群合理選擇食物中FA的種類具有肯定的指導作用,為NAFLD的預防及治療提供了科學依據(jù)。
[Abstract]:With the improvement of people's living standards and the decrease of physical activities, the incidence of obesity and related metabolic diseases has increased significantly, and then the health of the body has been damaged. In this paper, we used combinatorial biology technology to establish the cell model of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Fatty acid (FA) was used to investigate the molecular mechanism of apoptosis, oxidative stress, immune regulation and lipid metabolism in NAFLD. Cell viability assay, LDH cell necrosis assay, Hoechst 33342 staining for cell apoptosis assay, oil red O staining and triglyceride (TG) quantitative assay, and scanning electron microscopy for cell membrane damage detection were used to establish NALD model (maximum lipid precipitation and low cytotoxicity) in accordance with the law of human natural diseases. Exploration. The expression of immune factors in diet was investigated by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry (FCM) and Hoechst 33342/PI fluorescence microscopy, antioxidant and oxidative stress assays, differential proteomics, WB and ELISA combined with fluorescence quantitative PCR. Effects of A species on apoptosis, immune regulation and oxidative stress in human hepatic steatosis cells and the mechanism of promoting NAFLD to further liver injury were investigated. MTT cell activity assay, oil red O staining, TG qualitative and quantitative assay, fluorescence quantitative PCR of lipid metabolism genotype, ELISA and WB were used to study the effect of MCFA on NAFLD. The main results of this study are summarized as follows: In the first chapter, the biological characteristics of MCFA and the research progress of NAFLD are reviewed respectively, and the molecular mechanism of NAFLD is prospected. Advances in the study of NAFLD include the pathogenesis, establishment of models, apoptosis, oxidative stress, immune regulation and related lipid metabolism signaling pathways. Chapter 2 provides the best conditions for the establishment of NAFLD models in accordance with the laws of human natural diseases. The effects of mixed FA (oleic acid: palmitic acid = 2:1) and single FA (oleic acid) on the proliferation and apoptosis of L02 and HepG2 hepatocytes were investigated by MTT and LDH mutual validation. The results showed that the toxicity of FA on both L02 and HepG2 hepatocytes was time-and concentration-dependent. When the concentration of FA was lower than 400 mu M, there was no effect on the cell viability, and L. The results of Hoechst staining showed that the degree of apoptosis was positively correlated with the concentration of FA. When the concentration was less than 400 mu M, no apoptosis was observed compared with the control group. When the concentration was raised to 800 mu M, the apoptosis could be induced. Qualitative observation of lipid droplets and cell morphology by oil red O staining and quantitative determination of intracellular TG by phosphoglycerol oxidase showed that FA mixture was more suitable for establishing hepatic steatosis cell model than single FA. When mixed FA and LO2 cells incubated for 24 hours and the final concentration was 200 mu M, it reached Chapter 3 investigates the effects of dietary FA on apoptosis and oxidative stress in human hepatic steatosis cells, and explores the mechanism of promoting NAFLD to further liver injury. Compared with LCFA, MCFA can significantly reduce early hepatic steatosis. The results of oxidation analysis showed that LCFA could inhibit the production of antioxidant enzymes by protein two-dimensional electrophoresis and secondary mass spectrometry; furthermore, the determination of SOD, MDA, GSH and ROS also showed that MCFA did not produce oxidative stress, but LC did. The results showed that FA could inhibit the further damage of hepatic steatosis cells by changing the types of FA in diet, and could not promote the further deterioration of the disease. The results of NO and iNOS assay showed that the levels of NO and iNOS were not increased in MCFA group compared with NR group, and the levels of NO and iNOS were not significantly increased in LCFA group. The results of this chapter show that FA-induced apoptosis of hepatic steatosis cells does not depend on NO and iNOS pathways, and LCFA can strongly induce cellular immune response. The intake of MCFA-containing lipids plays a positive role in the further deterioration of NAFLD to NASH. Chapter 5 Excessive lipid deposition in the liver can lead to the disorder of hepatocyte function, thereby promoting fatty liver. This chapter explores the effects of MCFA on lipid metabolism in NAFLD cells and attempts to find alternatives to fat in the diet. Oil red O staining and TG assays suggest that compared with LCFA (oleic acid, C18:1), MCFA can significantly reduce liver steatosis L. The results of RT-PCR and WB showed that MCFA could down-regulate the expression of LPL, FAS, ACC, LXR-alpha, CD36 and SREBP-1 adipogenesis genes in hepatic steatosis cells by down-regulating the expression of LPL, FAS, ACC, LXR-alpha, CD36 and SREBP-1 adipogenesis genes, and up-regulating the expression of ATGL and HSL in hepatic steatosis cells. Chapter 6 Conclusion and prospect summarize the molecular mechanism of MCFA on apoptosis, antioxidant system, immune regulation and lipid metabolism of NAFLD cell model, and prospect the follow-up research. In this paper, the establishment of NAFLD cell model and the biological effects of MCFA on cell viability and apoptosis, antioxidant system, lipid precipitation and immune response were studied. The mechanism of lipid metabolism and immune regulation by MCFA was discussed at cellular and molecular levels. Rational selection of FA types in food for obese people has a positive guiding role, which provides a scientific basis for the prevention and treatment of NAFLD.
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TS221;TS201.4

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本文編號：2204685