發(fā)布時間：2024-09-29 20:31

　　植物生長發(fā)育受到多種因素的調(diào)控,其中外部因素,如光照、溫度、濕度等,對其正常的生長發(fā)育具有關(guān)鍵作用。植物的光合作用為其生命活動提供能量,而且光照也可以作為一種輸入信號引起植物體內(nèi)發(fā)生相應變化,隨時調(diào)控植物的生長發(fā)育狀態(tài)。溫度也是植物生長發(fā)育不可或缺的因子之一,在長期的進化過程中,植物體內(nèi)也形成了一套復雜的感知以及響應外界溫度變化的系統(tǒng),可以很好地適應環(huán)境溫度的升高或降低。然而,過強的光照或過激的溫度變化均會對植物的生長發(fā)育帶來不利影響,甚至導致其死亡。因此,探究植物如何感受外界環(huán)境的變化以及這種變化如何通過調(diào)控內(nèi)在的信號傳導網(wǎng)絡以促使植物做出適應性改變,對于我們更好地改良農(nóng)作物品質(zhì)及增加產(chǎn)量具有重要的指導意義。本研究在模式植物擬南芥中開展,主要研究SHB1與CCA1/LHY形成的蛋白復合體特異性地在紅光條件下調(diào)控PIF4基因的表達。PIF4(PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4)是植物光形態(tài)建成過程中關(guān)鍵的負調(diào)控因子之一,參與調(diào)控植物生長發(fā)育的多個方面,同時也是植物熱形態(tài)建成過程中的關(guān)鍵因子;SHB1(SHORT HYPOCOTYL UNDER BLUE 1)...

【文章頁數(shù)】：114 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 植物光形態(tài)建成
        1.1.1 植物光受體
            1.1.1.1 光敏色素
            1.1.1.2 隱花色素與向光素
            1.1.1.3 UVR
        1.1.2 光敏色素互作因子
            1.1.2.1 PIFs的結(jié)構(gòu)特點
            1.1.2.2 PIF4 多方面地參與調(diào)控植物生長發(fā)育
    1.2 植物生物節(jié)律
        1.2.1 擬南芥生物鐘核心振蕩器的分子機制
        1.2.2 光、溫信號與生物鐘之間的聯(lián)系
    1.3 SHB1 在植物光形態(tài)建成中的作用
    1.4 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與質(zhì)粒
        2.1.3 酶與試劑
        2.1.4 儀器設備
        2.1.5 引物
    2.2 實驗方法
        2.2.1 各種培養(yǎng)基配方
        2.2.2 植物材料的生長
            2.2.2.1 擬南芥種子消毒處理及萌發(fā)
            2.2.2.2 擬南芥植物的正常生長
            2.2.2.3 擬南芥植物的高溫條件處理
            2.2.2.4 擬南芥幼苗下胚軸長度的測量
        2.2.3 構(gòu)建擬南芥轉(zhuǎn)基因植物
            2.2.3.1 植物基因組DNA的提取(SDS法)
            2.2.3.2 PCR擴增目的基因片段
            2.2.3.3 目的片段的回收(試劑盒法)
            2.2.3.4 TOPO TA連接反應
            2.2.3.5 大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)法)
            2.2.3.6 PCR篩選方向及質(zhì)粒提取(試劑盒法)
            2.2.3.7 LR反應
            2.2.3.8 PCR鑒定陽性菌
            2.2.3.9 農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)法)
            2.2.3.10 浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥植物
        2.2.4 雙、三突變體的構(gòu)建及鑒定
            2.2.4.1 擬南芥植物的雜交
            2.2.4.2 PCR鑒定純合突變體
        2.2.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)
            2.2.5.1 植物總RNA的提取(試劑盒法)
            2.2.5.2 反轉(zhuǎn)錄
            2.2.5.3 qRT-PCR的引物設計及合成
            2.2.5.4 qRT-PCR的反應體系及結(jié)果分析
        2.2.6 染色質(zhì)免疫共沉淀分析(ChIP)
            2.2.6.1 染色體與蛋白交聯(lián)
            2.2.6.2 染色體準備(4°C)
            2.2.6.3 免疫共沉淀(4°C)
            2.2.6.4 洗脫與解交聯(lián)
            2.2.6.5 沉淀DNA
        2.2.7 免疫共沉淀分析(Co-IP)
            2.2.7.1 植物總蛋白的提取
            2.2.7.2 免疫共沉淀
            2.2.7.3 Western blot
        2.2.8 酵母單雜交(Y1H)
            2.2.8.1 pAbAi-Bait質(zhì)粒的構(gòu)建及線性化
            2.2.8.2 Y1H酵母感受態(tài)細胞的制備
            2.2.8.3 酵母菌的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的篩選
            2.2.8.4 pAbAi-Bait酵母菌株的AbA抗性檢測
            2.2.8.5 制備含有pAbAi-Bait質(zhì)粒的酵母感受態(tài)細胞以及不同GAD質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.2.9 雙分子熒光互補分析(BiFC)
            2.2.9.1 煙草轉(zhuǎn)化
        2.2.10 雙分子熒光素酶活性分析
            2.2.10.1 擬南芥葉片原生質(zhì)體的提取與轉(zhuǎn)化
            2.2.10.2 LUC/REN活性檢測
3 結(jié)果與分析
    3.1 SHB1、CCA1/LHY特異性地在紅光條件下調(diào)控PIF4 的表達
        3.1.1 SHB1 在紅光條件下特異性地誘導PIF4 基因表達
        3.1.2 SHB1 在紅光條件下促進PIF4 蛋白積累
        3.1.3 CCA1、LHY參與調(diào)控PIF4 基因表達
    3.2 SHB1、CCA1、LHY與 PIF4 的遺傳關(guān)系鑒定
    3.3 SHB1與CCA1/LHY上調(diào)PIF4 基因表達可增強植物的熱形態(tài)建成
    3.4 SHB1 通過CCA1/LHY關(guān)聯(lián)至PIF4 基因啟動子區(qū)域
        3.4.1 SHB1 在紅光條件下與PIF4 基因啟動子相關(guān)聯(lián)
        3.4.2 CCA1/LHY在紅光條件下可結(jié)合至PIF4 基因啟動子
        3.4.3 CCA1/LHY在黑暗條件下無法結(jié)合PIF4 基因啟動子
        3.4.4 SHB1與CCA1/LHY結(jié)合PIF4 基因啟動子符合PIF4 基因的節(jié)律表達模式
    3.5 CCA1/LHY可直接結(jié)合至PIF4 基因啟動子中的M1 元件
    3.6 SHB1與CCA1/LHY相互作用
    3.7 SHB1 N端與CCA1/LHY C端互作
    3.8 CCA1/LHY與 SHB1 共同作用于PIF
4 討論
    4.1 SHB1 通過上調(diào)PIF4 表達有助于維持植物光形態(tài)建成的動態(tài)平衡
    4.2 SHB1 特異性地調(diào)控PIF4 基因的表達
    4.3 PIF4 蛋白水平與轉(zhuǎn)錄水平具有一致的節(jié)律表達模式
    4.4 CCA1/LHY在黑暗條件下無法結(jié)合至PIF4 基因啟動子
    4.5 SHB1-CCA1/LHY復合體結(jié)合PIF4 基因啟動子符合其節(jié)律表達模式
5 結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表論文情況



本文編號：4006294