發(fā)布時間：2020-11-15 12:52

　　 核酸是生物體內攜帶遺傳信息的生物大分子,20世紀80年代,托馬斯·切赫(Thomas Cech)和西德尼·奧爾特曼(Sidney Altman)等發(fā)現(xiàn)了具有催化活性的RNA分子,并將其命名為核酶(ribozyme或RNAzyme)。核酶作為一種非蛋白質酶,它的發(fā)現(xiàn)對于酶學的研究以及RNA功能與結構的探索起到了重要推動作用。1994年,由杰拉爾德·喬伊斯(Gerald Joyce)和羅納德·布瑞克(Ronald Breaker)通過體外篩選技術獲得一種可以催化RNA斷裂的單鏈DNA分子,他們將這類能夠起到催化作用的DNA分子稱為脫氧核酶(deoxyribozyme或DNAzyme)。隨著對其功能研究的深入,結構方面的探索也日益增加,目前已發(fā)現(xiàn)了10-23脫氧核酶、9DB1脫氧核酶、8-17脫氧核酶的晶體結構。脫氧核酶的種類日益增加,應用領域也逐漸廣泛。近年來,利用其結構的優(yōu)越性已經在基因沉默、生物傳感器、DNA折紙(DNA Origami)等領域有了廣泛應用。2014年,唐卓研究員實驗室通過體外篩選獲得了一種名為F-8的新型DNA斷裂活性脫氧核酶。我們以F-8脫氧核酶序列和二級結構為基礎,設計順式結構的F-8SL脫氧核酶,鑒定發(fā)現(xiàn)了該脫氧核酶多種新輔因子與抑制因子,進而分析探討其反應機制;明確斷裂位點、磷酸基團歸屬及對電泳遷移速度影響;表征了催化核心單位點突變與活性關系。首先,我們檢測維生素類、酚類、胺類等25種化合物對F-8SL脫氧核酶斷裂活性的影響。鑒定“維生素C/錳離子”組合為F-8SL脫氧核酶最佳輔因子,黃素單核苷酸(FMN)、熒光素鈉可以與光照產生協(xié)同作用大幅提高脫氧核酶的催化活性。其他新輔因子鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚、鄰苯三酚、間苯三酚、鄰苯二胺、羥胺與錳離子共同作用下也能夠在不同程度上促進F-8SL脫氧核酶斷裂催化活性。隨后,我們對F-8SL脫氧核酶的斷裂機制進行了分析探討,分別檢測了羥自由基、過氧化氫、超氧陰離子(O_2~(·–))在反應過程中所起的作用。利用鐵卟啉-過氧化氫,鳥嘌呤四鏈體-鐵卟啉-過氧化氫體系,對于羥自由基所起作用進行了探究,數(shù)據(jù)顯示羥自由基沒有參與反應過程。利用過氧化氫酶(CAT)抑制實驗,證明過氧化氫在脫氧核酶的斷裂反應過程起到重要作用,并通過能產生過氧化氫的過氧碳酸鈉、“葡萄糖/葡萄糖氧化酶”組合進一步證明。利用過氧化氫/錳離子、維生素C/錳離子,鄰苯二胺/錳離子,對苯二酚/錳離子反應體系進行超氧陰離子抑制實驗,加入超氧化物歧化酶后有抑制活性作用。在此基礎上,我們推測并驗證了氮藍四唑或蛋白質細胞色素C也能夠具有較強的抑制脫氧核酶活性。這些實驗數(shù)據(jù)顯示在DNA氧化斷裂過程中超氧陰離子可能起到關鍵性作用。此外,斷裂位點研究過程中,我們以F-8SL為基礎設計并優(yōu)化出F-8SR1、F-8SR2以及F-8SR3三種脫氧核酶,利用變性聚丙烯酰氨凝膠電泳以及飛行時間質譜,對DNA斷裂位點進行了研究,鑒定F-8SL脫氧核酶斷裂片段5’末端、3’末端帶有磷酸基團。攜帶磷酸基團單鏈DNA電泳速率快慢與其脫氧核苷酸組成有關聯(lián),并非都呈現(xiàn)電泳速率加快現(xiàn)象。最后,對脫氧核酶催化中心的12個堿基進行了單位點突變研究,在四組不同輔因子條件下檢測了突變位點與催化活性關系,數(shù)據(jù)顯示脫氧核苷酸A4、T5、C6位點表現(xiàn)出高度的非保守性,為我們進一步設計“光調控活性脫氧核酶”提供了明確的改造位點。在本論文中,我們獲得了F-8SL脫氧核酶的多種輔因子和抑制因子,提出了其可能的催化機制,分析了斷裂位點,明確了催化核心中非保守性的核苷酸。斷裂位點分析以及催化核心單位點突變體的研究為后續(xù)的人工設計新型結構脫氧核酶奠定了基礎。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q55
【部分圖文】：

第 1 章 緒論開關(thiaminepyrophosphateriboswitch，TPPribosw位于大腸桿菌 mRNA 的 5’端非編碼區(qū)，可以直接結有蛋白質分子的參與情況下，這個 mRNA 是編碼維桿菌就可以通過感受焦磷酸硫胺素含量來調節(jié)維生核開關有維生素 B12 核糖開關、黃素單核苷酸核開核開關、鳥嘌呤核開關、腺嘌呤核開關等。

吉林大學碩士學位論文部位并束縛住這兩個亞結構單元。晶體結構顯示 P1部位，其中 P1 穿過 P2 核心結合配體，這個重要局撐，P3-P4 區(qū)可以在低濃度鎂離子情況下協(xié)助催化核核酶）是已知的唯一依賴小分子活化的天然催化活，被葡糖胺-6-磷酸（glucosamine-6-phosphate，GlcNA 磷酯轉移發(fā)生自身斷裂反應，進而調控降低葡糖減少葡萄糖胺-6-磷酸的合成量，作用機理如圖 1.2 所的葡糖胺-6-磷酸合成酶的代謝產物。葡糖胺-6-磷LCNAC）生物合成的第一步產物，而 UDP-N-乙酰基分子。

-17 和 10-23 脫氧核酶從多個角度展開大量的基礎研究，斷裂位點分析[25, 26]、催化核心突變[27-29]、脫氧核苷酸修-49]、晶體結構[50, 51]、催化機制[52-59]等方面。這些研究直的應用研究。本實驗室曾將脫氧核酶插入到單鏈 DNA 載基因表達[60, 61]。更多的研究人員集中在基于脫氧核酶構年來向細胞內金屬離子[62-64]、RNA[65-67]以及蛋白質[68]檢還有的研究人員擅長利用脫氧核酶設計分子邏輯門（logi）[70]，這豐富了脫氧核酶的應用領域。西奧爾卡（Jerzy Ciesio ka）研究團隊通過體外篩選獲得的脫氧核酶，稱之為 Dz15，如圖 1.3 所示[71]。該脫氧核需要金屬離子的參與，并且在反應溶液酸性條件下（pH大于 5.0 時則完全失去活性。
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5 王同慧;凌保東;;脫氧核酶在細菌研究領域的現(xiàn)狀與展望[J];中國抗生素雜志;2013年07期

6 潘秀頡,林麗,任安經,潘燕霞,王偉忠,袁文俊;內皮素-1 10-23脫氧核酶對離體灌流大鼠心臟急性缺血性心律失常的影響[J];心臟雜志;2004年06期

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本文編號：2884782