發(fā)布時間：2025-01-09 06:04

　　1.異育銀鯽尾鰭細胞系的建立及其對CyHV-2的敏感性研究本實驗中,我們建立了異育銀鯽尾鰭細胞系,命名為GiCF。原代培養(yǎng)的GiCF細胞形態(tài)多樣,主要呈上皮樣細胞和纖維樣細胞的特點,穩(wěn)定傳代后細胞呈纖維樣細胞的特點。該細胞系在20-30℃溫度范圍內(nèi)均可生長,最適生長溫度為25℃。染色體數(shù)目分布在140-166之間,有35%的中期分裂相的染色體縱數(shù)在156,3n=156為三倍體。用從患病異育銀鯽腎臟和脾臟中提取的病毒懸液感染GiCF細胞,7天后細胞出現(xiàn)明顯的病變現(xiàn)象,細胞收縮、變圓、脫落和細胞質(zhì)空泡化;感染9天后,病變現(xiàn)象更加明顯,出現(xiàn)大量的細胞脫落現(xiàn)象。用傳至20代的CyHV-2感染細胞,細胞病變情況更加嚴重,感染7天后,細胞大量脫落、死亡,證明GiCF細胞對CyHV-2敏感,可用于CyHV-2的增殖。另外,CyHV-2感染GiCF細胞后出現(xiàn)明顯的凋亡小體,TUNEL染色也能觀察到明顯的凋亡陽性信號,AnexinⅤ/PI染色結(jié)果表明病毒感染后發(fā)生凋亡細胞的數(shù)量顯著上升。說明CyHV-2感染能引起GiCF細胞產(chǎn)生凋亡。2.CyHV-2感染異育銀鯽m RNA轉(zhuǎn)錄組和小RNA轉(zhuǎn)錄組研究利用Il...

【文章頁數(shù)】：123 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要 Abstract 引言 第一章 文獻綜述
1 鯉皰疹病毒II型研究進展
    1.1 病毒學(xué)
    
1.1.1 CyHV-2的生物學(xué)特征
    
1.1.2 CyHV-2的基因組
    1.2 CyHV-2的流行特點
    
1.2.1 國內(nèi)外流行情況
    
1.2.2 傳播途徑
    1.3 臨床癥狀及病理特征
    1.4 CyHV-2的診斷方法
    
1.4.1 CyHV-2細胞培養(yǎng)分離技術(shù)
    
1.4.2 電鏡診斷技術(shù)
    
1.4.3 分子診斷技術(shù)
    1.5 診斷和防治
    
1.5.1 免疫相關(guān)研究進展
    
1.5.2 疫苗與防治研究進展
    1.6 小結(jié)
2 皰癥病毒miRNA研究進展
    2.1 病毒miRNA的發(fā)現(xiàn)和鑒定
    2.2 皰疹病毒miRNA的功能
    
2.2.1 皰疹病毒miRNA影響病毒的裂解/潛伏狀態(tài)
    
2.2.2 皰疹病毒miRNA影響細胞凋亡及細胞分化
    
2.2.3 皰疹病毒miRNA影響腫瘤發(fā)生
    
2.2.4 皰疹病毒miRNA影響免疫反應(yīng)
    2.3 皰癥病毒miRNA研究進展小結(jié)
3 細胞凋亡的研究進展
    3.1 細胞凋亡的信號通路
    
3.1.1 線粒體通路
    
3.1.2 死亡受體通路
    
3.1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路
    3.2 細胞凋亡相關(guān)的調(diào)控因子
    
3.2.1 Caspase家族
    
3.2.2 Bcl-2家族
    
3.2.3 ROS
    3.3 病毒感染與細胞凋亡
    
3.3.1 細胞凋亡是細胞對病毒的一種防御機制
    
3.3.2 病毒誘導(dǎo)細胞凋亡
    
3.3.3 病毒感染與細胞凋亡 第二章 異育銀鯽尾鰭細胞系的建立及其對CyHV-2的敏感性研究
2.1 實驗材料
    2.1.1 異育銀鯽
    2.1.2 病毒
    2.1.3 主要試劑和耗材
    2.1.4 儀器和設(shè)備
2.2 實驗方法
    2.2.1 原代及傳代培養(yǎng)
    2.2.2 最適培養(yǎng)溫度的確定
    2.2.3 細胞系物種來源鑒定
    2.2.4 核型分析
    2.2.5 CyHV-2病毒的分離
    2.2.6 CyHV-2的鑒定與滴度分析
    2.2.7 免疫熒光技術(shù)和WesternBlot檢測CyHV-2感染的GiCF細胞
    2.2.8 CyHV-2誘導(dǎo)GiCF細胞發(fā)生凋亡
    2.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析
2.3 實驗結(jié)果
    2.3.1 GiCF細胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)
    2.3.2 不同培養(yǎng)溫度對細胞生長的影響
    2.3.3 細胞系物種來源鑒定
    2.3.4 細胞核型分析
    2.3.5 CyHV-2病毒的分離
    2.3.6 CyHV-2的鑒定及滴度檢測
    2.3.7 CyHV-2感染的免疫學(xué)檢測
    2.3.8 CyHV-2誘導(dǎo)GiCF細胞發(fā)生凋亡
2.4 討論
2.5 小結(jié) 第三章 CyHV-2感染異育銀鯽mRNA轉(zhuǎn)錄組和小RNA轉(zhuǎn)錄組研究
3.1 實驗材料
    3.1.1 異育銀鯽
    3.1.2 病毒
    3.1.3 主要試劑和耗材
    3.1.4 儀器和設(shè)備
3.2 試驗方法
    3.2.1 攻毒實驗
    3.2.2 樣品采集
    3.2.3 總RNA的提取
    3.2.4 總RNA質(zhì)量監(jiān)控
    3.2.5 mRNA轉(zhuǎn)錄組高通量測序
    3.2.6 smallRNA高通量測序
    3.2.7 miRNA目標基因的預(yù)測
    3.2.8 miRNA實時熒光定量PCR
    3.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析
3.3 結(jié)果
    3.3.1 總RNA質(zhì)量檢測
    3.3.2 轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果分析
    3.3.3 小RNA測序結(jié)果分析
    3.3.4 miRNA長度分布及表達量分析
    3.3.5 miRNA差異表達分析
    3.3.6 miRNA靶基因預(yù)測及富集分析
3.4 討論
3.5 小結(jié) 第四章 CyHV-2編碼miRNA的鑒定及功能分析
4.1 實驗材料
    4.1.1 異育銀鯽
    4.1.2 病毒
    4.1.3 主要試劑和耗材
    4.1.4 儀器和設(shè)備
4.2 方法
    4.2.1 CyHV-2編碼miRNA的分析
    4.2.2 Stem-loopRT-qPCR法驗證CyHV-2編碼的miRNA
    4.2.3 Northernblot驗證CyHV-2編碼的miRNA
    4.2.4 CyHV-2感染過程病毒拷貝數(shù)定量檢測
    4.2.5 mRNA實時熒光定量PCR驗證
    4.2.6 CyHV-2編碼miRNA靶基因預(yù)測及富集分析
    4.2.7 雙熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建
    4.2.8 突變質(zhì)粒的構(gòu)建
    4.2.9 Hela細胞的培養(yǎng)
    4.2.10 利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miRNA的靶基因
4.3 結(jié)果
    4.3.1 CyHV-2感染異育銀鯽過程中smallRNA測序及分析
    4.3.2 CyHV-2編碼miRNA的驗證
    4.3.3 CyHV-2感染后腎臟中的病毒拷貝數(shù)和差異表達基因的檢測
    4.3.4 miRNA靶基因預(yù)測及富集分析
    4.3.5 利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miRNA的靶基因
4.4 討論
4.5 小結(jié) 第五章 miR-C12通過下調(diào)caspase8的表達抑制CyHV-2誘導(dǎo)的細胞凋亡
5.1 實驗材料
    5.1.1 異育銀鯽
    5.1.2 病毒
    5.1.3 試劑耗材
    5.1.4 儀器設(shè)備
5.2 方法
    5.2.1 過表達miRNA對CyHV-2誘導(dǎo)細胞凋亡的影響
    5.2.2 miR-C12靶基因的預(yù)測及驗證
    5.2.3 siRNA抑制caspase8對CyHV-2誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響
    5.2.4 Z-IETD-FMK抑制caspase8對CyHV-2誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響
    5.2.5 miR-C12抑制caspase8對CyHV-2誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響
    5.2.6 miR-C12抑制CyHV-2誘導(dǎo)的凋亡對病毒復(fù)制的影響
5.3 結(jié)果
    5.3.1 過表達miR-C12抑制CyHV-2誘導(dǎo)細胞凋亡
    5.3.2 miR-C12靶基因的預(yù)測及驗證
    5.3.3 病毒感染對miR-C12和caspase8表達的影響
    5.3.4 siRNA敲降caspase8抑制CyHV-2誘導(dǎo)的細胞凋亡
    5.3.5 Z-IETD-FMK抑制caspase8降低CyHV-2誘導(dǎo)的細胞凋亡
    5.3.6 miR-C12通過降低caspase8的表達抑制CyHV-2誘導(dǎo)的凋亡
    5.3.7 miR-C12抑制CyHV-2誘導(dǎo)的凋亡促進病毒復(fù)制
5.4 討論
5.5 小結(jié) 參考文獻 附錄 博士期間科研成果 致謝



本文編號：4025263