發(fā)布時(shí)間：2020-06-20 18:30

【摘要】：棉花是我國(guó)最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,在我國(guó)的種植歷史優(yōu)久,但長(zhǎng)期以來(lái),棉花產(chǎn)量的增加和纖維品質(zhì)的提升受到極端環(huán)境條件的限制,其中以干旱和高鹽脅迫影響最為嚴(yán)重。因此發(fā)掘棉花抗逆的關(guān)鍵基因,研究棉花的抗逆分子機(jī)制,創(chuàng)制更加耐鹽耐旱的棉花新品種對(duì)我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族,廣泛參與植物的生物與非生物脅迫響應(yīng)中。在本研究中首次鑒定并克隆得到一個(gè)棉花WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)該基因功能進(jìn)行驗(yàn)證,利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。本研究獲得的主要結(jié)果如下:1.目的基因克隆及序列分析。目的基因GhWRKY6核酸序列全長(zhǎng)1575 bp,包含有6個(gè)外顯子,525個(gè)氨基酸,在靠近N端的位置有一個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域。蛋白序列比對(duì)表明其與擬南芥AtWRKY6互為同源基因。2.基因表達(dá)模式的分析。利用qRT-PCR分析GhWRKY6在棉花不同組織中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)該基因在根、莖、葉組織中表達(dá)量很高,但在其他組織中表達(dá)量極低,尤其是胚珠中,說(shuō)明GhWRKY6具有較明顯的組織表達(dá)特異性;在ABA、NaCl和PEG6000處理下,GhWRKY6的表達(dá)量均有明顯升高,說(shuō)明GhWRKY6的表達(dá)受非生物脅迫誘導(dǎo)。3.GhWRKY6轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)非生物脅迫敏感。在ABA、高鹽和干旱處理?xiàng)l件下,GhWRKY6轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥相比,種子萌發(fā)率下降、生物量降低、主根縮短、過(guò)氧化物的積累和電導(dǎo)率增加、氣孔開度較大,說(shuō)明在擬南芥中過(guò)表達(dá)GhWRKY6基因增加了擬南芥對(duì)ABA、高鹽和干旱脅迫的敏感性。4.利用VIGS技術(shù)干涉GhWRKY6在棉花中的表達(dá)發(fā)現(xiàn),降低GhWRKY6的表達(dá)量,棉花對(duì)鹽脅迫的耐受性有所增加。TRV::GhWRKY6株系比對(duì)照株系在高鹽脅迫下具有更低的鹽害指標(biāo)和失水率,過(guò)氧化物積累也明顯減少,說(shuō)明GhWRKY6在棉花鹽脅迫反應(yīng)過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用。5.對(duì)TRV::GhWRKY6和TRV::00分別進(jìn)行RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn),兩者之間篩選出494個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)的基因,1372個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)的基因。GO(Gene ontology)分析顯示顯著上調(diào)表達(dá)的基因主要富集在氧化還原過(guò)程、膜成分、應(yīng)激反應(yīng)和脯氨酸生物合成過(guò)程等通路中;顯著下調(diào)表達(dá)基因主要在核小體成分、核小體組裝、氧化還原過(guò)程和代謝過(guò)程等通路中。GhWRKY6在棉花非生物脅迫響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中除了涉及到ABA信號(hào)途徑之外,其他的信號(hào)通路也可能受GhWRKY6的影響。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)和基因干涉技術(shù)對(duì)GhWRKY6的功能進(jìn)行了驗(yàn)證,從植物表型到細(xì)胞代謝水平再到基因轉(zhuǎn)錄水平逐步深入的揭示了GhWRKY6作為負(fù)調(diào)控因子在植物應(yīng)答干旱和高鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S562
【圖文】：

棉花非生物脅迫響應(yīng)基因 GhWRKY6 的功能驗(yàn)證及調(diào)控機(jī)制的研究3. 結(jié)果與分析3.1 棉花 GhWRKY6 基因的克隆使用 RNAprepPure 多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒（天根）提取陸地棉中棉4 組織的總 RNA，配置濃度為 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的 RNA 的質(zhì)量。使膠成像系統(tǒng)觀察膠塊上的條帶，可以看到 28S 和 18S 兩條清晰的條帶，且前者的是后者的 1.5 到 2 倍。使用 NanDrop2000 測(cè)定 RNA 的 OD260/280 比值，結(jié)果均.8-2.1 之間，說(shuō)明提取的 RNA 質(zhì)量較高，沒(méi)有蛋白雜質(zhì)等物質(zhì)的污染（圖 1-A）。到的總 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 作為 PCR 模板，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR ，得到 1575 bp 的目的條帶（圖 1-B），經(jīng)測(cè)序得到 PCR 產(chǎn)物的序列并與參考基序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者核酸序列幾乎完全匹配。

圖 2 GhWRKY6 基因的結(jié)構(gòu)分析Fig 2. Structural analysis of the GhWRKY6 geneA GhWRKY6 基因結(jié)構(gòu)；B WRKY 保守結(jié)構(gòu)域的位置A GhWRKY6 gene structure; B Position of WRKY conserved domain3.3 GhWRKY6 編碼的蛋白序列分析及進(jìn)化分析在 EXPASY 網(wǎng)站上的 ProtParam 對(duì) GhWRKY6 基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，該蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量為 57.629 kD，理論等電點(diǎn)為 6.95，分子式為C2444H3919N761O804S25，脂肪酸系數(shù)為 66.15，平均親水性為-0.772，不穩(wěn)定系數(shù)為 41.0，根據(jù) Guruprasad 等方法的計(jì)算結(jié)果表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。利用 SignalP4.0 Server通過(guò)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對(duì) GhWRKY6 基因編碼蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，該蛋白的 N 端至第 70 位氨基酸之間剪切位點(diǎn)分值（C-Value）和綜合剪切分值（Y-Value）無(wú)明顯峰值，說(shuō)明該蛋白的 N 端不存在剪切位點(diǎn)，表明其不包含信號(hào)肽，推測(cè)其為非分泌蛋白。利用 TMHMM2.0SERVER 對(duì) GhWRKY6 基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，其中1~525 個(gè)氨基酸沒(méi)有峰值表明不存在跨膜蛋白，因此推測(cè)其不具有跨膜結(jié)構(gòu)為細(xì)胞膜

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本文編號(hào)：2722799