發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 13:12

　　 芝麻莖點(diǎn)枯病是由菜豆殼球孢(Macrophomina phaseolina)引起的真菌性土傳病害,對(duì)芝麻的產(chǎn)量和質(zhì)量造成了嚴(yán)重威脅。因此,挖掘抗病基因,選育和種植抗病品種,對(duì)保證芝麻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有十分重要的意義。本研究用不同地區(qū)的44個(gè)芝麻品種進(jìn)行田間芝麻莖點(diǎn)枯病的抗性鑒定。借助轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果挑選出兩個(gè)抗芝麻莖點(diǎn)枯病相關(guān)基因SiPYL4、SiTLP,對(duì)SiPYL4、SiTLP進(jìn)行了克隆,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體,對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了抗病性鑒定,主要得到以下結(jié)果:1、對(duì)不同地區(qū)的44個(gè)芝麻品種進(jìn)行了田間芝麻對(duì)莖點(diǎn)枯病的抗性鑒定,鑒定結(jié)果表明,沒(méi)有高抗和免疫品種,中抗(MR)芝麻種質(zhì)資源為26份,占供試種質(zhì)的59.1%;中感(MS)芝麻種質(zhì)資源共14份,占供試種質(zhì)的31.82%;高感(HS)芝麻種質(zhì)資源2份,占供試種質(zhì)4.55%。2、利用同源克隆技術(shù)克隆出SiPYL4、SiTLP基因。SiPYL4全長(zhǎng)645bp,編碼215個(gè)氨基酸,SiTLP全長(zhǎng)681bp,編碼227個(gè)氨基酸。3、對(duì)抗感芝麻品種進(jìn)行菜豆殼球孢脅迫處理后,進(jìn)行熒光定量分析,結(jié)果SiPYL4在抗病品種鄭芝13中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),在36 h時(shí)表達(dá)量較高,在感病品種冀9014中72h也出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)。SiTLP基因在抗、感品種中脅迫處理12h時(shí)同時(shí)出現(xiàn)表達(dá)量明顯上升的情況,在感病品種冀9014中24h時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)最高峰。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)SOD、POD、CAT、H_2O_2含量也隨之增加。4、超表達(dá)SiPYL4、SiTLP的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型相比有著較高的生長(zhǎng)活性。菜豆殼球孢脅迫7天后野生型擬南芥感病癥狀明顯,嚴(yán)重的整株枯死,轉(zhuǎn)基因擬南芥只有底部蓮座葉片有輕微枯黃。轉(zhuǎn)基因擬南芥的活性氧清除能力也明顯強(qiáng)于野生型擬南芥,因此推測(cè)SiPYL4、SiTLP基因在擬南芥抗菜豆殼球孢侵染過(guò)程中起關(guān)鍵作用。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S435.653
【部分圖文】：

圖 1.3 菜豆殼球孢菌（A：菜豆殼球孢在 PDA 培養(yǎng)基上的形態(tài)；B：菜豆殼球孢菌核；C：菜豆殼球孢分生孢子器和分生孢子）Fig 1.3 (A: Macrophomina phaseolina morphology on PDA medium;B: Sclerotia ofMacrophomina phaseolina;C: Conidia and conidium of Macrophomina phaseolina)1.3.2 發(fā)病時(shí)期與癥狀在芝麻幼苗期，菜豆殼球孢最先侵染子葉時(shí)期的芝麻，特別是雨后天氣放晴達(dá)到侵染的最佳時(shí)期，病苗根部會(huì)受到嚴(yán)重侵害直至死亡。在芝麻枯死后芝麻莖稈上會(huì)產(chǎn)生許多小黑點(diǎn)，這些小黑點(diǎn)就是菜豆殼球孢的分生孢子器和菌核。在芝麻成株期時(shí)，莖點(diǎn)枯病主要集中在芝麻開(kāi)花及結(jié)蒴果時(shí)期。病原菌首先侵染芝麻的根部然后從根部往莖部逐漸蔓延，根部受侵害部位首先腐爛枯死，黑色的菌核布滿芝麻的皮層，待病原菌蔓延至地表以上芝麻莖基部時(shí)，初期發(fā)病部位呈淺褐色，隨著發(fā)病面積的擴(kuò)大顏色逐漸加深，發(fā)病后期病斑顏色變?yōu)楹诤稚�，莖稈表面上密布黑色的菜豆殼球孢的分生孢子器。由于黑色小菌核侵入芝麻皮層內(nèi)，導(dǎo)致芝麻莖稈組織受到嚴(yán)重壞死。發(fā)病嚴(yán)重的芝麻植株，從莖基部至芝麻頂部甚至全株葉片都會(huì)枯萎卷縮[33]。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期豫芝 11 與 Mp2010028C 苗期互作的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，拼接的 SiPYL4 和 SiTLP 序列，在芝麻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 Blast 比對(duì)得到一致性為百分之百的序列，在 NCBI 中的編號(hào)分別為 SiPYL4：LOC105167014，SiTLP ： LOC105157575 。其中 SiPYL4-like(Sesamum indicum abscisic acidreceptor)注釋為芝麻脫落酸受體 PYL4 類似蛋白，全長(zhǎng) 972bp,位于芝麻 7 號(hào)染色體（LG7:10587814:10588455:- ），SiTLP（Sesamum indicum thaumatin-likeprotein ） 注釋為芝麻類甜蛋白基因，全長(zhǎng) 920bp, 位于芝麻 1 號(hào)染色體（LG1:6869724:6870404:+）。以鄭芝 13 芝麻葉片 cDNA 為模板，分別以引物SiPYL4-F/R、SiTLP-F/R 克隆 SiPYL4、SiTLP 基因的 cDNA 全長(zhǎng)片段；以引物SiPYL4-F/R、SiTLP-F/R 克隆 SiPYL4-like、SiTLP 基因的 DNA 基因組全長(zhǎng)，擴(kuò)增結(jié)果顯示 SiPYL4、SiTLP 基因的 cDNA 全長(zhǎng)和 DNA 基因組全長(zhǎng)片段大小相等，PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖 3.1A 和 B。其中 SiPYL4 基因片段為 645bp、SiTLP基因片段大小為 681bp。又分別在抗莖點(diǎn)枯病芝麻品種：鄭芝 13、新蔡選抗、商水農(nóng)家種、豫芝 4 號(hào)、豫芝 11，感病品種：冀 9014、Fy1201、Fy1202、晉芝 3 號(hào)中進(jìn)行 SiPYL4、SiTLP 基因的擴(kuò)增，結(jié)果如圖 3.2A和 B。

3 芝麻 SiPYL4、SiTLP 基因的分子克隆與鑒定為 SiTLP 基因）B:（M 為 DL2000bp DNA ladder marker、1~2 泳SiPYL4 基因，3~4 泳道為 SiTLP 基因）。.1 A: Full-length cDNA fragment of SiPYL4 and SiTLP genes;B: Full-length clonSiPYL4 and SiTLP gene DNA genome): A (M is DL2000bp DNA ladder marker, lane 1~2 is SiPYL4 gene, lane 3~4 is Si is DL2000bp DNA ladder marker, lane 1~2 is SiPYL4 gene, lane 3~4 is SiTLP
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本文編號(hào)：2893050