失血性休克是臨床常見的危重癥，經(jīng)歷休克和復(fù)蘇存活的患者往往會(huì)發(fā)生難以控制的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)致終末器官損傷。肺是最易受累器官之一，研究表明多種因素導(dǎo)致失血性休克后急性肺損傷(acutelung injury，ALI)的發(fā)生，其中炎癥介質(zhì)在休克后ALI和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory dis—tress syndrome，ARDS)的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并成為該類患者死亡的主要原因 。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制失血性休克大鼠模型，觀察c肽對失血性休克大鼠血漿中促炎性細(xì)胞因子表達(dá)以及肺炎癥反應(yīng)程度的影響，探討其發(fā)生機(jī)制，為探尋新的治療策略提供思路。

　　1 材料與方法

　　1．1 動(dòng)物來源與分組 雄性Wistar大鼠(3～4月齡，體重300～350 g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分為3組，每組8只。假手術(shù)組(Sham組)：麻醉后實(shí)施手術(shù)但未失血和復(fù)蘇；乳酸鈉林格液復(fù)蘇組(RL組)：麻醉后實(shí)施手術(shù)，失血致休克，予以乳酸林格液復(fù)蘇；C肽復(fù)蘇組(c肽組)：麻醉后實(shí)施手術(shù)，失血致休克，予以C肽復(fù)蘇。

　　1．2 動(dòng)物模型制作 2％戊巴比妥鈉50 mg／kg腹腔注射麻醉，分離一側(cè)股動(dòng)、靜脈并置人套管，股動(dòng)脈套管監(jiān)測平均動(dòng)脈壓及留作放血，股靜脈套管注入復(fù)蘇液體和放出的血液，放出的血液儲(chǔ)存于無菌加肝素的容器中備用。所有實(shí)施手術(shù)后的大鼠觀察10 min以達(dá)到穩(wěn)態(tài)(大鼠血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)平穩(wěn)并有自主呼吸)。以0．5 mL／min速度股動(dòng)脈放血至平均動(dòng)脈壓(MAP)降為(40～50 mmHg，40±5 mmHg)，維持此血壓，期間根據(jù)MAP的波動(dòng)情況放出或回輸血液使MAP維持于此范圍內(nèi)。1h后迅速復(fù)蘇。

　　RL組：乳酸林格液于30 min內(nèi)輸入(總?cè)萘康扔诳偸а��?；C肽組：1 mg／kg C肽溶于生理鹽水于30 min內(nèi)輸入(總?cè)萘康扔诳偸а��?；Sham組大鼠僅作動(dòng)靜脈置管并維持測壓狀態(tài)同樣時(shí)程。各組分別于復(fù)蘇2h后經(jīng)股動(dòng)脈采血2 mL，離心后取上清于一70℃ 凍存。放血處死大鼠。部分肺組織固定于福爾馬林用于組織學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)用Ma．clab生物信號采集系統(tǒng)監(jiān)測心率和血壓。

　　1．3 實(shí)驗(yàn)室檢測 各組在麻醉、插管結(jié)束后穩(wěn)定10 min，記錄基礎(chǔ)MAP，在休克模型建立及復(fù)蘇期間每30 min重復(fù)記錄一次；采用ONE TOUCH2 LIFES—CAN血糖自動(dòng)分析儀測定血糖水平；采用ELISA法測定血漿白細(xì)胞介素一1(IL一1)、白細(xì)胞介素一6(IL一6)、腫瘤壞死因子一 (TNF—d)水平。所有試劑均購自武漢博士德公司。

　　Westing-blot檢測肺組織核轉(zhuǎn)錄因子(NF—KB)蛋白表達(dá)水平：肺組織加入細(xì)胞裂解液于勻漿器中勻漿后提取總蛋白，筆耕論文新浪博客，考馬斯亮藍(lán)法測定樣品總蛋白含量。蛋白質(zhì)按SDS．PAGE電泳分離，BioRad電轉(zhuǎn)移裝置電轉(zhuǎn)移蛋白至硝基纖維素膜，麗春紅可逆染色確定蛋白Mark位置，依次加一抗、二抗，TTBS洗膜，BCIP／NBT顯色、拍照。各蛋白的相對含量以目的蛋白與內(nèi)參照B一肌動(dòng)蛋白(3-actin)蛋白表的灰度比值表示。

　　采分光光度計(jì)法測定肺組織髓過氧化物(MPO)活性。

　　1．4 肺組織學(xué)分析 取肺組織固定于4％ 中性福爾馬林，脫水、石蠟包埋、切片，HE染色。高倍鏡下觀察肺組織的病理改變。

　　1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用方差分析；所有統(tǒng)計(jì)分析均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2．1 各組MAP變化各組初始狀態(tài)(0 min)MAP沒有差異，平均值在130 mmHg左右。模型復(fù)制后RL組、c肽組(30～60 min)MAP穩(wěn)定于45±5 mm—Hg，Sham組不變。復(fù)蘇后2 h，C肽組MAP明顯高于RL組(t= 一11．07，P<0．01)。

　　2．2 血糖水平、血漿IL一1、IL一6、TNF． 水平、肺組織MPO含量及NF—KB蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，三組血糖水平無差異(P>0．05)；與Sham組相比較，c肽組與RL組肺組織MPO活性均升高(P<0．O1)，血漿IL一1、IL一6、TNF- 水平顯著升高(P<0．01)，肺組織NF-KB蛋白表達(dá)增加(P<0．01)；C肽組與RL組相比，肺組織MPO活性、血漿IL一1、IL一6、TNF一0水平、肺組織NF-KB蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0．01)。

　　2．3 肺組織病理學(xué)變化 RL組肺組織肺泡壁增厚，肺間質(zhì)水腫，肺泡腔內(nèi)有大量的紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤；C肽組肺組織炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，肺間質(zhì)和肺泡病理改變明顯減輕。

　　3 討 論失血性休克復(fù)蘇后發(fā)生嚴(yán)重的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致ALI和ARDS的主要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)，胰島素原分子的裂解產(chǎn)物c肽與細(xì)胞膜G蛋白偶聯(lián)受體特異性結(jié)合后可產(chǎn)生多種細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)，改善器官和細(xì)胞的功能，發(fā)揮調(diào)節(jié)和保護(hù)作用。

　　MPO是反映呼吸系統(tǒng)炎癥和損傷的一個(gè)良好指標(biāo)，與中性粒細(xì)胞的聚集程度有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，c肽組與RL組相比，肺組織MPO活性明顯降低，提示c肽可減輕失血性休克后中性粒細(xì)胞浸潤和肺損傷。病理學(xué)檢測也發(fā)現(xiàn)，RL組大鼠肺組織有典型病理學(xué)改變，表現(xiàn)為肺泡壁增厚、肺間質(zhì)水腫、肺泡腔內(nèi)有大量的紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤等，而C肽組上述病理改變則明顯減輕。我們認(rèn)為，在失血性休克再灌注階段予以c肽可減輕肺組織損傷和炎癥反應(yīng)，而這種保護(hù)作用可能與C肽調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子如P．選擇素、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM一1)及血管細(xì)胞黏附分子一1(VCAM一1)的表達(dá)有關(guān)。Vish等 通過復(fù)制非DM嚙齒動(dòng)物膿毒血癥模型，發(fā)現(xiàn)c肽可減輕肺間質(zhì)、肺泡水腫，減輕肺泡損傷及炎性細(xì)胞浸潤，認(rèn)為c肽參與調(diào)控炎性反應(yīng)。Scalia等 研究發(fā)現(xiàn)，在腸系膜損傷的大鼠，c肽可減少腸系膜血管內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子P一選擇素及ICAM．1的表達(dá)，從而減輕白細(xì)胞滾動(dòng)與粘附，減輕了血管損傷。而在非糖尿病(Diabetes mellitus，DM)動(dòng)物如敗血癥和心肌缺血一再灌注損傷，c肽可介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮胞間相互作用，調(diào)節(jié)一氧化氮(NO)生成及中性粒細(xì)胞浸潤，從而發(fā)揮抗炎作用 。因此C肽作為一重要的調(diào)控因子在失血性休克時(shí)可能抑制肺組織炎癥反應(yīng)，減輕ALI。

　　由于ALI是肺組織失控性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，NF—KB作為一重要促炎轉(zhuǎn)錄因子，參與組織損傷、炎癥反應(yīng)等。本研究發(fā)現(xiàn)c肽組NF．KB表達(dá)水平明顯低于RL組，提示C肽可能通過抑制NF．KB核轉(zhuǎn)位而弱化一些重要促炎介質(zhì)如TNF—o、IL一1、IL一6等，減輕失血性休克后肺組織炎癥反應(yīng)，減輕肺損傷。同時(shí)本研究中c肽組與RL組血漿TNF．IL．1、IL．6水平明顯高于Sham組，而與RL組相比，c肽組血漿TNF一0l、IL一1、IL一6水平明顯下降，從而進(jìn)一步證實(shí)了c肽對炎癥的鈍化效應(yīng) 。