【摘要】 目的以大鼠坐骨神經(jīng)的慢性壓迫性損傷（chronic constriction injury，CCI）為疼痛模型，觀察大鼠脊髓水平Reelin的表達(dá)變化情況，探討其與神經(jīng)病理性疼痛的相關(guān)性。方法雄性SD大鼠132只，體重250-350g，采用隨機(jī)設(shè)計(jì)分為2組：假手術(shù)組（Sham組，n=48）、慢性壓迫性損傷組（CCI組，n=84）。Sham組予暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)主干不結(jié)扎，CCI組予建立右側(cè)坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型。各組大鼠均于術(shù)前1天、術(shù)后1d、4d、7d、10d、14d、21d、28d測量雙側(cè)后足底痛行為學(xué)指標(biāo)，包括機(jī)械縮足閾值（paw withdrawal mechanical threshold, PWMT）和熱縮足潛伏期（pawwithdrawal thermal latency, PWTL）。留取大鼠腰段脊髓組織，采用RT-PCR、Westernblot檢測脊髓背角Reelin mRNA、Reelin蛋白表達(dá)量隨時(shí)間的表達(dá)變化；。結(jié)果1.疼痛行為學(xué)變化：各組大鼠術(shù)前PWMT和PWTL差異無顯著性；Sham組術(shù)前與術(shù)后PWMT和PWTL差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而CCI組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)PWMT和PWTL均出現(xiàn)不同程度降低（P＜0.01）。2. RT-PCR結(jié)果顯示：與Sham組相比，Reelin mRNA在腰段脊髓背角水平的表達(dá)量從CCI術(shù)后第4天開始減少（P <0.05），第7天至28天出現(xiàn)顯著的下降（P<0.01）；雙變量相關(guān)分析顯示：大鼠脊髓背角Reelin mRNA表達(dá)量與其PWMT呈正相關(guān)（rp=0.795，P <0.05），前者與其PWTL呈正相關(guān)（rp=0.845，P <0.01）。3. Western blot結(jié)果顯示：與Sham組相比，Reelin蛋白在脊髓背角的表達(dá)量從CCI術(shù)后第4天開始減少（P <0.05），第7，10天顯著下降（P <0.01），第14，21，28天繼續(xù)降低（P <0.01）；雙變量相關(guān)分析顯示：大鼠脊髓背角Reelin蛋白表達(dá)量與其PWMT呈正相關(guān)（rs=0.746，P <0.05），前者與其PWTL呈正相關(guān)（rp=0.819，P <0.05）。結(jié)論慢性壓迫性神經(jīng)痛大鼠脊髓水平Reelin的表達(dá)下調(diào)，且這種變化與神經(jīng)痛的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，Reelin表達(dá)變化可能對(duì)慢性壓迫性神經(jīng)痛的產(chǎn)生或發(fā)展有重要意義。 

前 言

坐骨神經(jīng)痛（Sciatica）是一種常見的神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain），其治療一直是困擾臨床醫(yī)生的難題。最常見病因?yàn)檠�椎間盤突出，以及血管壓迫、感染或惡性腫瘤等其他原因，但其發(fā)病機(jī)理尚未明確。病人常表現(xiàn)為下肢劇烈放射性疼痛 (Radiating pain)、間歇性跛行 (Intermittent claudication)、自發(fā)性痛 (Spontaneouspain) 和痛覺過敏 (Hyperalgesia) 等癥狀，約有 1/3 的患者這些癥狀會(huì)持續(xù) 2 年以上，嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量，也更易導(dǎo)致病人失去工作能力并耗費(fèi)更多的醫(yī)療資源[1,2]。因此對(duì)坐骨神經(jīng)痛的病生機(jī)制的研究，對(duì)尋找其治療的理想途徑有著重要意義。Reelin 是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于對(duì) Reeler 鼠的研究，這種基因突變鼠因?yàn)闊o法編碼表達(dá) Reelin 導(dǎo)致大腦皮層發(fā)育異常，而出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)等異常行為[3]。胚胎期主要由 Cajal–Retzius 細(xì)胞合成和分泌，Reelin-Dab1 信號(hào)通路在大腦發(fā)育過程中對(duì)神經(jīng)元遷移、定位發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。后來發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)細(xì)胞遷徙完成后，Cajal–Retzius 細(xì)胞幾乎完全消失，但 Reelin 仍持續(xù)存在發(fā)育成熟的大腦中，且主要由γ-氨基丁酸能神經(jīng)元（GABAergic neurons）分泌[4]，Reelin 表達(dá)異常與阿茲默海病、精神分裂癥和雙向情感障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)[5]，Reelin 在維持大腦功能穩(wěn)定方面的作用一直是研究的焦點(diǎn)。
近來研究發(fā)現(xiàn) Reeler 鼠脊髓背角（spinal dorsal horn）的第Ⅰ—Ⅲ板層神經(jīng)元的定位出現(xiàn)異常，此處是收集和處理 Aδ和 C 傷害性感受器的傳入纖維傳入信息的中樞，進(jìn)一步的行為學(xué)測試，發(fā)現(xiàn) Reeler 鼠的感覺也存在異常，表現(xiàn)為對(duì)機(jī)械刺激的敏感度下降，而對(duì)熱輻射刺激敏感程度上升[6,7]。另外，Reelin 可以通過調(diào)節(jié) N-甲基- D-天冬氨酸受體 ( N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)的構(gòu)型來改變其功能[8,9]，NMDAR 介導(dǎo)的突觸后膜胞漿內(nèi) Ca2+增加，被認(rèn)為是脊髓水平中樞敏化機(jī)制的關(guān)鍵，中樞敏化是慢性疼痛的重要機(jī)制之一[10]。綜上，可以推測 Reelin 很可能參與脊髓水平的疼痛反應(yīng)的調(diào)節(jié)，而國內(nèi)外關(guān)于Reelin 的這一作用尚未見報(bào)道，為了證明 Reelin 在坐骨神經(jīng)痛的過程中發(fā)揮了作用，本研究以大鼠坐骨神經(jīng)的慢性壓迫性損傷（chronic constriction injury，CCI）為疼痛模型，，觀察大鼠脊髓水平 Reelin 的表達(dá)有無改變。
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材料與方法

1 材料

2 方法
2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Sprague Dawley (SD)大鼠，體重250~350 g，由南華大學(xué)動(dòng)物部提供。每籠四只，晝夜節(jié)律為12 h–12 h，室溫為22 ± 2°C，自由進(jìn)食和取水。所有的實(shí)驗(yàn)都經(jīng)過南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)和使用協(xié)會(huì)批準(zhǔn)，參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南[11]，盡力減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷害，并盡量減少動(dòng)物使用數(shù)量。
2.2 CCI 模型的制備 SD大鼠腹腔注射戊巴比妥（40mg / kg）麻醉后，按Bennet 和 Xie方法[12]制作CCI模型，俯臥位，消毒，鋪巾，選擇右后肢，在股骨下方約l cm平行于股骨切開皮膚，用小剝離子經(jīng)股二頭肌間隙鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用神經(jīng)剝離子輕柔將坐骨神經(jīng)與周圍軟組織分離。在坐骨神經(jīng)分成三支前的主干部位游離神經(jīng)7 mm 左右，在距神經(jīng)起始處 ( 三支分叉處)上方2 mm處， 用4.0含鉻羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道，每道間隔約1 mm，使被結(jié)扎的神經(jīng)長約4~5 mm。注意結(jié)扎的松緊度，以打結(jié)時(shí)可見肌肉輕微抽動(dòng)為準(zhǔn)；局部生理鹽水沖洗，間斷縫合肌肉筋膜、皮下組織以及皮膚（見圖1）；術(shù)畢將大鼠放入鼠籠，于溫暖、安靜環(huán)境自由喂養(yǎng)；假手術(shù)組除不結(jié)扎坐骨神經(jīng)外，其余同模型組；手術(shù)由同一人操作。

前 言........6
材料與方法.....7
結(jié) 果....... 17
討 論....... 25
結(jié) 論....... 28
綜 述....... 32

討 論

本文主要證實(shí)了脊髓水平Reelin在慢性壓迫性神經(jīng)痛大鼠模型中的表達(dá)出現(xiàn)了下調(diào)。以往對(duì) Reelin 的研究，關(guān)注大腦水平的神經(jīng)功能紊亂的居多，一般集中在認(rèn)知功能障礙或精神疾病，近來有少量報(bào)道發(fā)現(xiàn)脊髓板層中 Reelin 表達(dá)異�？梢�起痛覺過敏[6,15]，但尚未有研究闡釋慢性壓迫性神經(jīng)痛與脊髓水平 Reelin 表達(dá)情況的關(guān)系。本文的研究成果不僅發(fā)掘了 Reelin 在神經(jīng)病理性疼痛中可能存在的作用，也為探索慢性壓迫性神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)制提供了新思路。神經(jīng)病理性疼痛的研究多數(shù)源于動(dòng)物模型，盡管目前模型與臨床實(shí)際情況仍存在差距。慢性病理性疼痛模型主要分為兩大類：炎癥性及神經(jīng)源性。神經(jīng)病理性疼痛的病理機(jī)制比較復(fù)雜，病變部位可從外周感受器一直延伸到腦。神經(jīng)病理性疼痛一般伴有血管功能異常及炎癥現(xiàn)象。CCI 模型是經(jīng)典的神經(jīng)病理性疼痛模型之一，于 1988 年被 Bennett 和 Xie 首次復(fù)制。CCI 大鼠疼痛模型表現(xiàn)為自發(fā)痛(自發(fā)抬起損傷肢體，時(shí)而舔足、咬足或甩足，避免損傷側(cè)的負(fù)重)、痛覺過敏(機(jī)械痛敏和冷痛敏)、輕度或中度的自殘現(xiàn)象。該模型術(shù)后第 2 天開始出現(xiàn)痛反應(yīng)，10~14 d 達(dá)高峰，21d 以后開始逐漸恢復(fù)，持續(xù) 2個(gè)月后痛反應(yīng)消失。因此本次實(shí)驗(yàn)選擇術(shù)后第 1d、4d、7d、10d、14d、21d、28d檢測 Reelin 表達(dá)改變，貫穿了 CCI 模型神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、高峰和恢復(fù)期。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在大鼠 CCI 模型中，Reelin mRNA 和 Reelin 蛋白與腰段脊髓背角的表達(dá)持續(xù)減少，且 Reelin mRNA 的最低值（CCI 術(shù)后第 10 天）出現(xiàn)在 Reelin蛋白減少高峰期（CCI 術(shù)后第 14 至 28 天）之前，由此可見 Reelin 的減少不太可能是消耗或丟失引起的，而應(yīng)該與產(chǎn)生來源減少有關(guān)。
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結(jié) 論

慢性壓迫性神經(jīng)痛大鼠脊髓水平 Reelin 的表達(dá)下調(diào)，且這種變化與神經(jīng)痛的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，Reelin 表達(dá)變化可能對(duì)慢性壓迫性神經(jīng)痛的產(chǎn)生或發(fā)展有重要意義。含 NR2B亞單位的 NMDARs（NR2B-NMDARs）具有：1. 對(duì) Ca2+具有較高的選擇通透性；2. 離子通道的衰減時(shí)間明顯延長；3. 由其介導(dǎo)的興奮性突觸后電位(excitatorypostsynaptic potentials, EPSP) 也明顯增加；4. 其與胞內(nèi)的鈣調(diào)蛋白激酶 CaMKⅡ的親和力也較 NR2A 高[21]。NR2B-NMDARs 的離子通道特性決定了：NR2B 是調(diào)節(jié)NMDARs 誘導(dǎo) LTP 的產(chǎn)生并引起中樞敏化和神經(jīng)性疼痛的主要因素[22]。Reelin 一方面可以維持 NMDAR 中 NR2B 的低比例[9]，加速 NR2B 向 NR2A 的轉(zhuǎn)變[23]，另一方面也可以通過抑制 GSK-3β來降低 NR2B-NMDAR 在突觸上的穩(wěn)定性[24]。因此Reelin 可能通過降低 NR2B-NMDAR 的數(shù)量和功能來減弱其在痛覺過敏中的促進(jìn)作用。以上可能機(jī)制尚未有研究證實(shí)，Reelin 究竟是否參與了神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)，是通過何種途徑來發(fā)揮作用都需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。
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參考文獻(xiàn)（略）