【摘要】 本文由兩部分組成,通過兩篇文獻綜述回顧了白血病干細胞(leukemia stem cell,LSC)具有自我更新和無限增殖潛能,是造成白血病發(fā)生發(fā)展的根源。而且LSC處于靜止期,對化療藥物不敏感,易產(chǎn)生對多種化療藥物的交叉耐藥,一般細胞周期化療藥物很難對其發(fā)揮殺傷效果。加之LSC集中于藥物難以達到的骨髓區(qū)域以及具有天然耐藥特性,正好逃逸了抗癌藥物的攻擊,為急性白血病復發(fā)潛伏了禍根。當多數(shù)白血病患者處于臨床完全緩解狀態(tài)時,體內(nèi)仍殘留包括LSC在內(nèi)的微小殘留病灶會重新活躍進入細胞分裂周期,并很快自我更新,無限增殖,造成急性白血病復發(fā)。臨床觀察還發(fā)現(xiàn),部分難治性急性白血病患者一旦使用化療既會出現(xiàn)嚴重的骨髓抑制,但停藥后外周血或骨髓卻很快顯現(xiàn)大量的白血病細胞,且具有耐藥相關(guān)蛋白高表達特征,支持LSC具有高度增殖潛能與多藥耐藥的生物學特征。因此針對LSC源頭上的靶向干預治療是克服白血病多藥耐藥最有效途徑。我們前期研究發(fā)現(xiàn),復方浙貝顆粒聯(lián)合化療能夠提高難治性急性白血病患者臨床緩解率,效應(yīng)機制與誘導細胞凋亡、降低膜耐藥蛋白高表達、調(diào)節(jié)酶異常變化相關(guān),但均以白血病細胞為靶標,是否能針對LSC起到逆轉(zhuǎn)耐藥效應(yīng)缺乏深入研究。臨床研究主要為：1.研究目的通過觀察復方浙貝顆粒聯(lián)合化療對難治性急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者骨髓LSC表面分子標志物的影響及難治性AML患者白血病細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路和NF-κB信號通路中相關(guān)分子標記物(PI3K、mTOR、PTEN、 NF-κB)與骨髓周圍微環(huán)境相互作用的細胞表面標記物CD44表達變化,試圖明確復方浙貝顆粒逆轉(zhuǎn)多藥耐藥效應(yīng)靶點。2.研究方法全部病例資料來自北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院血液腫瘤科,北京大學人民醫(yī)院血液科,廊坊市中醫(yī)醫(yī)院血液科于2011年12月至2013年8月觀察的難治性AML患者。治療采用化療方案有HAE, MA, CAG, AA, EA, FLAG等,復方浙貝顆粒(浙貝母12克,川芎9克,防已9克)由北京康仁堂藥業(yè)有限公司制成中藥配方顆粒,于化療前3天開始服用復方浙貝顆粒,每次1袋,每日2次,共服用14天,21天為一療程。以流式細胞術(shù)分別檢測骨髓有核細胞中LSC表面分子標志物(CD34+CD123+、 CD33+CD123+)細胞表達比例。有30例患者完成治療前后對照,分別檢測了2次LSC表達比例；另外23例患者僅檢測了1次LSC表達比例。20例次在北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院血液腫瘤科住院的難治性AML患者行骨髓活檢術(shù)采集組織標本,以免疫組化技術(shù)檢測了CD44、PI3K、mTOR、PTEN、NF-κB表達情況。3.研究結(jié)果①難治AML中CD34+與CD33+CD123+細胞比例分別為11.78%、12.86%,兩者相關(guān)性分析顯示相關(guān)系數(shù)為0.953,兩者具有明顯相關(guān)性(p<0.001)。②按診療標準分類將難治性AML分為兩組,其中處于緩解狀態(tài)時患者的LSC表達比例分別為0.66%,0.92%,較處于復發(fā)狀態(tài)時LSC比例(20.73%,22.47%)明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.001)。③30例完成前后治療對照的難治性AML患者治療后LSC表面分子標志物細胞表達比例(5.49%,5.94%)較治療前明顯降低(17.05%,17.71%),差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。其中25例處于復發(fā)狀態(tài)時完成治療前后對照的患者進一步分析發(fā)現(xiàn),治療后LSC比例(6.82%,7.39%)也較治療前LSC比例(21.74%,22.48%)明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。治療后達到完全緩解有10例患者(有效率40%),且LSC表面分子標志物細胞表達比例分別為1.50%,1.65%,較未緩解患者明顯下降(11.65%,12.61%),差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。④20例取骨髓活檢患者中9例處于完全緩解的白血病細胞相關(guān)分子標記物CD44、PI3K、mTOR.PTEN.NF-κB陽性細胞表達率分別為22.2%、0%、33.3%、33.3%、77.8%,與11例未緩解的63.6%、0%、18.2%、63.6%、90.9%相比,CD44表達差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),陽性表達強度也提示CD44表達在兩組間有統(tǒng)計學差異。完全緩解的白血病細胞相關(guān)分子標記物CD44.PI3K.mTOR.PTEN.NFκB平均光密度分別為441.78、217.28、393.58、91.16、642.66,與未緩解的840.06、316.21、223.00、292.51、775.35相比,CD44表達差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。4.研究結(jié)論①CD34’CD123+與CD33+CD123+細胞具有顯著相關(guān),可以用來定位LSC。②LSC比例可以反映急性白血病患者是否處于持續(xù)緩解狀態(tài)。③復方浙貝顆粒是通過降低LSC表面分子標記物CD123、CD33表達比例,提高了難治性AML化療緩解率。④白血病細胞中CD44高表達可作為難治性AML預后判定的重要參考指標,PI3K/Akt/mTOR信號通路和NF-κB信號通路在白血病細胞中的作用需要進一步研究。 

綜述一白血病干細胞研究概述

1白血病干細胞的發(fā)現(xiàn)
胖瘤干細胞(cancer Stem cell, CSC)是目前臨床研究的熱點之一。多年的臨床觀察和實驗研究發(fā)現(xiàn)，雖然白血病細胞具有高度惡性，但大部分惡性細胞只能在體內(nèi)增殖，只有少量惡性細胞可在體外形成克隆生長。而且盡管所有惡性細胞的形態(tài)十分相似，其生物學特性卻存在很大差別。這都反映白血病患者體內(nèi)可能存在著CSC。CSC是白血病的起始細胞，它們在白血病的發(fā)生發(fā)展、復發(fā)和耐藥中起著重要的作用⑴。這群細胞可以移植到非肥胖性糖尿病嚴重聯(lián)合免疫缺陷（nonobesediabetic/severe combined immune deficient, NOD/SCID)小鼠體內(nèi)，誘導產(chǎn)生白血病，這也是目前鑒定CSC常用的實驗方法⑴。1994年，Lapidot等發(fā)現(xiàn)大部分急性髓系白血�。╝cute myeloid leukemia, AML)細胞只有有限的增殖能力，表明可能在白血病克隆里面存在著一群數(shù)量極少且具有無限增殖能力的干細胞，通過將白血病細胞移植給NOD/SCID小氣來鑒定AML啟動細胞，最后發(fā)現(xiàn)能在NOD/SCID小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量集落形成祖細胞的是CD34+CD38-細胞，這群細胞描述為‘‘SCID鼠人類白血病啟動細胞”（SCID leukaemia Lniat ing cell SL-IC )。1997 年 Bonnet 等通過大量的臨床樣本研究發(fā)現(xiàn)，在急性髓細胞白血病患者中僅有〔034++0038_細胞亞群具有自我更新和復制能力，雖然該類細胞亞群數(shù)量很少，但它們卻是唯一能將急性髓系白血病細胞在動物體內(nèi)繁衍復制繼承下來，這群白血病細胞被定義為“白血病干細胞（leukemia stem cell，LSC) ，并提出形成白血病的萬惡之源就是從此LSC的存在越來越多地獲得人們的公認。
動物實驗研究顯示，接種在小鼠體內(nèi)LSC所產(chǎn)生的大部分白血病細胞均為CD38+、HLA-Dir細胞，這些都是干細胞分化后產(chǎn)生的特異性表面標記細胞，表明LSC具有能向下游階段分化成熟的能力。局限稀釋法測定LSC的含量為0. 25%-1. 00%,而在接種LSC后的小鼠體內(nèi)可以檢測出n的保持CD34+CD38^性細胞，表明LSC在體內(nèi)進行了大量擴增，說明LSC具有自我更新能力。因此同正常造血干細胞(hematopoietic stein eel 1, HSC)—樣，LSC也具有自我復制，增殖潛能，多向分化能力等特點。正常HSC可通過不對稱分裂產(chǎn)生兩個子代細胞，一個仍然維持母代即HSC的特征，另一個則分化為前體細胞，前體細胞在有絲分裂過程逐漸喪失增殖能力，最終分化為各系血細胞，而LSC分化產(chǎn)生的是一個是維持LSC特征，另一個則為白血病原始細胞，，向下分化產(chǎn)生白血病細胞。
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2白血病干細胞的起源
盡管LSC既能自我更新和無限增殖，生存時間相對較長，具有許多與HSC相同的特征，但是關(guān)于LSC的來源仍存在很多爭議�，F(xiàn)代研究表明白血病的發(fā)生是在多種致病因素打擊下，白血病細胞累積點突變、基因重排或染色體易位等多個突變的綜合作用，最終惡性轉(zhuǎn)變成具有自我更新能力和增生、生存優(yōu)勢的LSC，這是一個多階段、多步騷過程。因此LSC是多重因素累積突變后的結(jié)果。動物實驗研究顯示，轉(zhuǎn)染了 PML/RARa融合基因的鼠模型并不能立即發(fā)生白血病，需要經(jīng)過較長潛伏期，才會出現(xiàn)白血病，而在RAR a陽性的HSC中加入Pim2 (proviral integration site ofmurine 2)蛋白，則可以明顯縮短小鼠發(fā)生白血病潛伏期，單一 RARa蛋白或Pim2蛋白都不能在小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生白血病_，表明LSC產(chǎn)生一般是由兩次或多次癌性突變產(chǎn)生后的結(jié)果。因此推測LSC形成的三種模式為：①HSC發(fā)生第一次突變形成前LSC，然后前LSC繼發(fā)第二次突變最終產(chǎn)生LSC,是由正常HSC突變產(chǎn)生LSC;②HSC發(fā)生突變后分化形成白Jfe病前期祖細胞，白血病前期祖細胞再發(fā)生第二次突變誘導產(chǎn)生LSC;③HSC正常分化形成造血祖細胞，但是受兩次突變打擊后產(chǎn)生LSC""，由此對于LSC起源有幾種不同認識。
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綜述二中藥逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥研究

1白血病多藥耐藥機制及治療措施
多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)產(chǎn)生機制以及如何克服白血病多藥耐藥一直是國內(nèi)外血液界研究的熱點課題。MDR發(fā)生是多因素、多機制共同作用的結(jié)局，目前，已經(jīng)明確的白血病多藥耐藥機制主要有以下幾種：①耐藥蛋白高表達：在耐藥的白血病細胞膜上存在有多種轉(zhuǎn)運蛋白，這些轉(zhuǎn)運蛋白高表達可以導致白血病細胞的多藥耐藥，如P-糖蛋白、多藥耐藥性相關(guān)蛋白、肺耐藥相關(guān)蛋白等。其共性特征是這些轉(zhuǎn)運蛋白通過主動轉(zhuǎn)運功能將化療藥物系出細胞外，從而降低了細胞內(nèi)抗癌藥物濃度，使白血病細胞能夠逃逸抗癌藥物對其殺傷效果。②相關(guān)酶變化：在白血病治療過程中，白血病細胞內(nèi)許多酶發(fā)生了異常改變，如蛋白激酶C、DNA拓撲異構(gòu)酶11、谷胱甘肽等，蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是一種絲蘇氣酸蛋白激酶，活化后可作用于細胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，促進細胞的增殖和分化。在多藥耐藥的胖瘤細胞中，多藥耐藥基因的高表達可導致Pgp活性井高，而通過Pgp的碟酸化可激活PKC，導致細胞對化療藥物抵抗，從而引起胖瘤細胞的多藥耐藥；TopoII是DNA進行復制必需的核疇，在細胞內(nèi)還參與基因的重組、轉(zhuǎn)錄及DNA修復等功能，同時也是許多化療藥物抗癌乾點，抑制TopoII的活性可以引起DM斷裂增加引起細胞調(diào)亡，而細胞內(nèi)TopoII含量的減少或者活性降低，導致抗癌藥物的作用耗點減少，誘導細胞抵抗藥物的敏感性，產(chǎn)生多藥耐藥活性。谷胱甘肽是細胞內(nèi)解毒系統(tǒng)的重要組成部分，在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶催化下，GSH可與多種抗脾瘤藥物結(jié)合，導致其水溶性增加，使藥物易于被細胞排泄到胞外，降低抗癌藥物的濃度，使對白血病細胞的殺傷減弱。③DM修復功能異常：DM損傷修復是細胞自身保護反應(yīng)。多數(shù)抗癌藥物是通過損傷DNA誘導細胞調(diào)亡發(fā)揮抗腫瘤活性的，而細胞本身也可通過自身修復機制抵抗化療藥物的傷害，其功能增強導致白血病細胞對化療藥產(chǎn)生拮抗，引發(fā)細胞多藥耐藥的產(chǎn)生。④細胞調(diào)亡受抑制：惡性胖瘤的產(chǎn)生與細胞過度增殖，調(diào)亡障礙等明顯相關(guān)，在白血病細胞體內(nèi)常存在著與細胞調(diào)亡調(diào)控的相關(guān)基因及其蛋白（BCL-2、BAX、FAS、FASL)異常表達，這些改變使白血病如胞調(diào)亡受阻，對抗癌藥物也不敏感，產(chǎn)生細胞多藥耐藥的特性。⑤其他機制，如細胞膜功能改變影響藥物的轉(zhuǎn)運和外排；激素受體量和親合力改變等也與白血病多藥耐藥密切相關(guān)。
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2白血病干細胞多藥耐藥機制
傳統(tǒng)化療藥物根本無法根除LSC是導致白血病復發(fā)的重要原因。由于LSC具有處于靜止期，自我更新，表達多藥耐藥蛋白，抗揭亡能力等生物學特征，使得LSC能夠逃避化療藥物的損害，在白血病復發(fā)和耐藥中起到關(guān)鍵的作用。通過對白血病干細胞耐藥機制的深入了解，有助于提高抗癌藥物的敏感性，進一步提高抗白i病治療的臨床療效，而且還可以發(fā)現(xiàn)新的抗白血病治療措施，為根治白血病帶來希望。白血病干細胞的多藥耐藥機制主要與以下因素相關(guān)：
2.1 LSC處于靜止期
目前臨床上所應(yīng)用的抗胖瘤藥物大多針對處于分裂期的惡性脾瘤細胞，以破壞細胞復制來達到抗脾瘤治療的效果，對處于靜止狀態(tài)的細胞，通常不能形成有效傷害。Dean等研究認為具有自我更新能力的白血病干細胞通常都處于靜止狀態(tài)，其在細胞周期中為GO期，能夠躲避化療藥物的傷害"=。王穎超等從人單核細胞白血病THP-1細胞中提取的CD34+CD38-LSC其細胞周期G0/G1期比例達94. 63%,進一步證明白血病干細胞處于不分離狀態(tài)1”。劉俊等從K562細胞株中檢測到的CD34+細胞群的G0/G1期細胞比例達80%左右。由此可見LSC通常處于細胞周期之外的休眠狀態(tài)。充分表明白血病干細胞處于靜止狀態(tài)可以造成細胞多藥耐藥。
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臨床研究 .......................46-66 
第一部分 復方浙貝顆粒聯(lián)合化療對AML干細胞影響的臨床觀察.............. 46-60 
前言........................ 46 
臨床資料 ........................46-47 
診療標準 ...........................47-48 
結(jié)果 ...............48-55 
討論.......................... 55-60 

第二部分 急性髓系白血病患者骨髓細胞相關(guān)分子標志物表達研究

前言
AML是發(fā)生在骨髓組織中的惡性腫瘤，與骨髓造血微環(huán)境有著密切關(guān)系，惡性細胞在骨髓腔內(nèi)大量增殖、調(diào)亡障礙和分化受阻，從而影響了骨髓正常造血功能，在臨床上表現(xiàn)為感染、發(fā)熱、貧iL、出血等癥狀。研究巳經(jīng)證實LSC在急性白血病發(fā)生、復發(fā)和耐藥中起著關(guān)鍵作用。一方面在于LSC自身異常的信號傳導通路，使得LSC可以實現(xiàn)自我更新、無限增殖；還有LSC周圍微環(huán)境也為細胞生存和發(fā)育提供重要的庇護場所，參與介導白血病復發(fā)和耐藥。因此LSC內(nèi)持續(xù)激活的信號傳導通路和與周圍微環(huán)境之間的相互關(guān)系，導致AML難以通過化療達到持續(xù)緩解，通過前一部分研究顯示復發(fā)浙貝顆粒聯(lián)合化療可以殺傷LSC,為進一步研究療效機制，我們通過檢測難治性AML患者體內(nèi)骨髓細胞自身信號傳導通路及其與周圍環(huán)境相互關(guān)系，明確其作用乾點。
臨床資料
1病例來源
2011年12月至2013年3月在北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院血液J!中瘤科共收集20例符合復發(fā)難治性急性白血病患者。依據(jù)急性白血病療效評價標準將患者分為臨床緩解組（9例），未緩解組（11例）。兩組病例入院時基本信息見表1，表2。
2研究方法
2.1試刻與儀器
超敏SP試劍盒（Kit-9710)、即用型兔抗NF-kappaB多克隆抗體及DAB顯色試剎盒購于福建邁新生物工程公司；兔抗人PnK多克隆抗體、抗PTEN多克隆抗體及抗CD44單抗均購自此京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；mTOR抗體購自美國San t Cruze公司；SPOT11 數(shù)碼成像系統(tǒng)（Diagnostic Instruments 公司產(chǎn)品）；Image pro plus 6.0 免疫組化彩色圖象分析系統(tǒng)（Media Cybernet ics公司）。
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結(jié)論

①CD34+CD123+與CD33+CD123+細胞具有顯著相關(guān)，可以用來定位LSC。
②LSC比例可以反映急性白血病患者是否處于持續(xù)緩解狀態(tài)。
③復方浙貝顆粒是通過降低LSC表面分子標記物CD123、CD33表達比例，提高了難治性AML化療緩解率。
④白血病細胞中CD44高表達可作為難治性AML預后判定的重要參考指標，P13K/ Ak t /mTOR信號通路和NF- k B信號通路在白血病細胞中的作用需要進一步研究。
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參考文獻（略）