發(fā)布時間：2014-12-26 10:35

 

【摘要】 目的：分析c-Met蛋白在結直腸癌（CRC）及CRC肝轉移病人不同組織中的表達情況，并評估c-Met蛋白在不同組織中陽性表達時，發(fā)生CRC肝轉移的危害值。分析在不同臨床分期的CRC患者c-Met及VEGF的血清表達水平，為臨床早期診斷提供臨床依據(jù)。方法：采用免疫組化S-P法對c-Met蛋白在結直腸正常黏膜、CRC原發(fā)瘤、CRC轉移淋巴結、CRC轉移瘤的表達水平進行分析，評估c-Met蛋白在不同組織中的陽性表達水平。組間率的比較采用χ2檢驗，非正態(tài)分布的計量資料，組間均數(shù)比較用秩和檢驗；分析c-Met在結直腸正常黏膜、CRC原發(fā)瘤、CRC轉移淋巴結、CRC轉移瘤中的mRNA表達水平，通過對新鮮的手術標本，進行RNA水平層面的驗證性試驗，采用χ2檢驗進行計數(shù)資料組間率的比較；通過Cox模型對單因素及多因素進行統(tǒng)計學分析，評估c-Met蛋白的陽性表達水平與CRC發(fā)生淋巴結轉移及肝轉移的關系。采用Cox proportional hazardregression模型評估單因素及多因素，評價指標為危害比（HR）及95%置信區(qū)間（95%CI）；采用Elisa法對CRC的患者的c-Met及VEGF的血清水平進行評估，探討c-Met與VEGF血清水平之間的關系。連續(xù)性變量采用獨立樣本t檢驗，相關性分析采用簡單線性相關分析。結果：⑴在正常結直腸粘膜組織中，c-Met蛋白呈弱陽性表達，表達率為5.22%。在CRC原發(fā)瘤組織中，c-Met蛋白的陽性表達率為35.07%，該比例顯著高于正常結直腸粘膜組織組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。CRC陽性淋巴結中，c-Met蛋白的陽性表達率為42.33%，該比例顯著高于正常結直腸粘膜組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；CRC肝轉移灶組c-Met蛋白的陽性表達率為52.14%，該比例顯著高于正常結直腸粘膜組織組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；CRC陽性淋巴結的c-Met陽性率顯著高于CRC原發(fā)瘤，差異具有統(tǒng)計學意義（42.33%vs35.07%，P=0.000）。CRC肝轉移灶的c-Met陽性率顯著高于CRC原發(fā)瘤，差異具有統(tǒng)計學意義（52.14%vs35.07%，P=0.000）；CRC肝轉移灶的c-Met陽性率顯著高于CRC陽性淋巴結，差異具有統(tǒng)計學意義（52.14%vs42.33%，P=0.041）。c-Met蛋白（+）組高、中、低分化程度的比例分別為22.36%、23.62%、54.02%，c-Met蛋白（-）組則分別為69.34%、25.37%、5.29%，組間差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；c-Met蛋白（+）組T1-4的比例分別為7.79%、11.06%、50.57%、30.58%，c-Met蛋白（-）組則分別為32.29%、33.65%、30.66%、3.39%，組間差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；c-Met蛋白（+）組淋巴結未轉移與淋巴結轉移者的比例分別為24.87%、75.13%，c-Met蛋白（-）組則分別為34.06%、65.94%，c-Met蛋白（+）組淋巴結轉移的比例顯著高于c-Met蛋白（-）組（75.13%vs65.94%，P＜0.05）；c-Met蛋白（+）組無遠處轉移和遠處轉移者的比例分別為86.93%、13.07%，c-Met（-）組則分別為97.96%、2.04%，c-Met蛋白（+）組遠處轉移的比例顯著高于c-Met蛋白（-）組（13.07%vs2.04%，P＜0.05）；c-Met蛋白（+）組腫瘤直徑（≤2、2-5、≥5cm）的比例分別為31.16%、32.91%、35.93%，c-Met蛋白（-）組則分別為30.39%、34.06%、35.55%，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。⑵以正常結直腸粘膜組織作為對照， c-Met mRNA相對含量為（0.572±0.051），當所測mRNA值/-actin值＞0.61時，為陽性表達。結直腸腺瘤組織（0.781±0.064），其c-Met mRNA含量與正常結直腸粘膜組織相似，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CRC、CRC陽性淋巴結、CRC肝轉移灶中c-MetmRNA含量分別為（1.138±0.174）（pg/ml）、（1.486±0.184）（pg/ml）、（1.372±0.168）（pg/ml），均顯著高于正常結直腸粘膜組，差異具有統(tǒng)計學意義（all P＜0.05）。CRC陽性淋巴結、CRC肝轉移灶中c-Met mRNA含量顯著高于CRC組織，差異具有統(tǒng)計學意義（all P＜0.05）。CRC陽性淋巴結與CRC肝轉移灶中c-Met mRNA含量相似，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.681）。⑶單因素分析納入了16個因素，其中危險因素為：性別（HR:1.222;95%CI:1.021-1.468，P=0.0482），年齡（HR:1.645;95%CI:1.315-2.062，P＜0.0001），家族史（HR:2.313;95%CI:1.811-7.651，P=0.0004），分化程度（P＜0.0001），體重減輕（HR:1.697;95%CI:1.320-2.092，P＜0.0001），T分期（P＜0.0001），N分期（P＜0.0001），CRC原發(fā)瘤c-Met表達（HR:5.558;95%CI:7.829-13.24，P＜0.0001），淋巴結c-Met的陽性表達（HR:4.982;95%CI:5.267-8.554，P＜0.0001），肝轉移灶c-Met表達（HR:4.324;95%CI:3.753-5.957，P＜0.0001），糖尿�。℉R:1.503;95%CI:1.222-2.072，P=0.0007）；預防因素分別為：術前放療（HR:0.5749;95%CI:0.4882-0.8029，P=0.0003），術前放化療（HR:0.2122;95%CI:0.3068-0.4833，P＜0.0001）。無統(tǒng)計學差異的是吸煙（HR:1.036;95%CI:0.8275-1.301，P=0.7525），飲酒（HR:0.970;95%CI:0.7740-1.214，P=0.7892），術前低蛋白（HR:1.169;95%CI:0.9256-1.504，P=0.1888）。多因素分析認為：T分期是CRC發(fā)生肝轉移較弱的危險因素（HR:1.161;95%CI:1.017-1.325，P=0.027）；其他作用較強的危險因素包括：分化程度（HR:3.601;95%CI:2.521-5.694，P=3.601）、N分期（HR:4.210;95%CI:3.45-5.137，P=4.210）、CRC原發(fā)瘤c-Met蛋白陽性表達（HR:1.678;95%CI:1.160-2.429，P=1.678）、CRC轉移淋巴結c-Met蛋白的陽性表達（HR:1.728;95%CI:1.437-3.212，P=1.728）、肝轉移灶c-Met蛋白的陽性表達（HR:2.964;95%CI:1.796-4.890，P=2.964）。其中N分期（HR:4.210）是影響CRC發(fā)生肝轉移最強的危險因素；術前放化療（HR:0.841;95%CI:0.417-0.934，P=0.841）則是CRC發(fā)生肝轉移的預防因素。⑷健康人群及CRC患者c-Met血清水平分別為（98.15±10.72）、（271.42±68.64），VEGF血清水平分別為（197.97±38.47）、（486.17±55.21）。CRC患者的c-Met、VEGF血清平均水平分別是健康人群的2.77倍和2.46倍，差異均具有統(tǒng)計學意義（all P＜0.05）。CRC患者的c-Met與VEGF血清水平呈正相關（r=0.9655，P＜0.0001）。按臨床分期劃分，I-IV的CRC患者c-Met血清水平分別為（155.97±40.59）、（216.35±16.36）、（301.72±14.54）、（356.61±14.98）。I-IV的CRC患者VEGF血清水平分別為（220.29±17.76）、（328.11±14.54）、（442.33±16.13）、（526.30±17.37）。I期CRC患者c-Met與VEGF并不呈相關性（r=-0.09675，P=0.7215），II、III、IV期CRC患者c-Met與VEGF均呈現(xiàn)正相關（all P＜0.05）。結論：（1）c-Met在CRC的疾病演變過程中扮演著重要角色，c-Met蛋白的表達水平可能與CRC疾病進展密切相關，當c-Met高表達時，可能預示著CRC的進展程度及惡性程度。（2）c-Met蛋白、 c-Met mRNA表達及c-Met血清水平升高具有同步性，當發(fā)生CRC肝轉移時，陽性轉移淋巴結、肝轉移灶c-Met mRNA的表達也顯著增加。（3）對c-Met蛋白在CRC原發(fā)瘤、CRC轉移淋巴結的表達水平進行檢測，有利于提高對CRC病人術后復發(fā)，轉移風險的預判。若c-Met蛋白陽性表達，其發(fā)生肝轉移的風險分別是c-Met蛋白陰性表達的1.678倍、1.728倍。（4）CRC患者的c-Met、VEGF血清水平分別是健康人群血清的2.77倍和2.46倍，CRC患者c-Met與VEGF血清水平呈正相關。對CRC患者進行c-Met的血清檢測，可能可以作為CRC患者診斷和術后監(jiān)控的手段之一。

臨床

盡管 CRC 的診斷和治療已有很大的進步，但其 5 年生存率仍徘徊在40%-60%，總體預后仍不能令人滿意。CRC 患者肝轉移的發(fā)生率較高，約達到50% [4]，且肝轉移常常是 CRC 治療失敗的常見原因之一 [4, 5]。盡管各種治療手段較多 [6]，但目前最佳的治療方法仍然是外科手術 [7]。然而，根據(jù)近期的一些大宗病例統(tǒng)計報告，CRC 肝轉移患者的手術切除率僅僅為 20-30% [8,9]，大部分的原因主要與患者的病期較晚、一般情況較差有關。CRC 肝轉移的患者如發(fā)現(xiàn)較早、一般情況較好，仍可行外科的根治性切除，約 1/3 的 CRC肝轉移患者根治性切除后的生存時間仍可以達到 5 年 [7-9]。但無手術治療機會患者的預后較差，生存時間一般難以超過 12 個月 [10, 11]。因此，針對 CRC患者的早診、早治、和預防復發(fā)/轉移等越來越受到關注，已成為 CRC 治療的熱點問題之一。許多學者認為，若能通過早期診斷 CRC 患者發(fā)生了肝轉移，并及早對高危群體給予預防性的措施，這有希望改善 CRC 肝轉移治療的臨床總體治療效果。
目前，針對 CRC 患者肝轉移的診斷主要是通過血清 CEA 水平的檢測及相關影像學檢查（B 超、CT、MRI 或 PET-CT）等方法來完成，然而 CEA 水平的升高缺乏針對 CRC 肝轉移診斷的特異性；而影像學的檢查對于微小病灶的診斷靈敏度往往較低，當影像學發(fā)現(xiàn)腫瘤的病灶時，往往提示了腫瘤的病情已進展到一定的階段；因此，當前的常規(guī)手段其敏感性和時效性均有待進一步提高，特別是對 CRC 患者肝轉移發(fā)生的幾率和風險性的預測，可能會導致臨床過程中要么盲目或過度的治療、要么可能導致診斷和治療的遲延。從而導致了部分 CRC 肝轉移的患者錯過了最佳的手術時機。故及時預測和早期診斷肝轉移成為了目前 CRC 治療的關鍵點。
現(xiàn)階段認為：惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多階段、多因素、多個生物調(diào)控通道參與的復雜過程。根據(jù)腫瘤的生物學特性，腫瘤組織中的癌細胞存在不均一性和異質(zhì)性。即原發(fā)腫瘤中存在著各種不同的亞組腫瘤細胞，它們的侵襲、轉移能力是不同的。某些高侵襲、高轉移表型的惡性腫瘤細胞，它們主要是受到相關的基因所決定和調(diào)控的。這些相關的基因發(fā)生異常改變后，它們對腫瘤細胞的惡性程度、增殖、粘附、侵襲、遷移及轉移等各種過程起到了至關重要的作用。故就理論而言，高侵襲與低侵襲性癌細胞的基因表達譜應該是不同的。
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第一章 c-Met 蛋白在結直腸癌不同組織中的表達水平

一、材料與方法 
1 材料
1.1 納入病例
所有組織標本取自廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院、貴港市人民醫(yī)院 2007 年1 月至 2011 年 6 月期間胃腸外科經(jīng)手術治療的 1135 例 CRC 患者，其中男性675 例，女性 460 例，年齡 16-80 歲，中位年齡 60 歲。根據(jù)病理類型分為：管狀腺癌 649 例，乳頭狀腺癌 342 例，粘液腺癌 144 例。按腫瘤的分化程度分為：高分化腺癌 154 例，中分化腺癌 381 例，低分化腺癌 600 例；按國際抗癌聯(lián)盟( UICC)1997 年修訂的 PTNM 分期標準分為：I 期 169 例，II 期 392 例（I+II 期 551 例），III 期 457 例，IV 期 117 例（III+IV 期 574 例）。同時，選擇相同時間段內(nèi)結直腸正常黏膜切片 134 例作為正常對照組，其中男性 83 例，女性 51 例，年齡在 40-75 歲之間，中位年齡為 56 歲。所選擇的 CRC 病例均經(jīng)外科手術治療，并經(jīng)過術后病理證實。所有 IV 期的 CRC 患者均選取伴隨淋巴結轉移的病例，若不伴隨淋巴結轉移者予以剔除。所有 CRC 病例均無其他嚴重內(nèi)科疾病或伴發(fā)其他惡性腫瘤，所有 CRC 遠處轉移患者均選取肝轉移患者，若合并其他部位轉移者予以剔除。
2 方法
2.1 實驗儀器
（1）電熱安全壓力鍋：廣東美的生活電器制造有限公司，型號為 MY-CS60；
（2）轉輪石蠟切片機：德國 LEICA 公司， 型號為 RM2235；
（3）高壓滅菌消毒鍋：日本 TOMY， 型號為 SS-325；
（4）烤箱：上海躍進， 型號為 101-2-BS；
（5）病理圖象分析儀器：日本 OLYMPUS 公司， 型號 DP-BSW；
（6）光學顯微鏡：重慶市光學儀器廠；
（7）病理圖像分析軟件：美國 Media Cybernetics 公司，軟件版本 Image-Pro Plus6.0；
（8）全自動照相裝置：日本 OLYMPUS 公司，型號 BX60F5 PM20-35
（9）微量移液器（10μl、20μl、200μl、500μl）：北京青云公司；
（10）奧林巴斯雙目顯微鏡：日本 OLYMPUS 公司， 型號 CX41；
（11）PHY-Ⅲ型病理組織漂烘處理儀：常州中威電子儀器廠；
（12）多聚賴氨酸防脫載玻片：上海市太陽生物技術有限公司，型號 T-005-1；（13）4℃冰箱：容聲冰箱廠；
（14）微波爐：格蘭仕集團,廣東順德制造；
（15）ID-Ⅲ型快速生物醫(yī)學實驗儀濕盒：日本松下電器公司；
（16）PHS-25 型酸度計：上海市雷磁儀器廠；
（17）實驗用 Tip 頭用 0.1%DEPC 處理過的水浸泡后，均進行 120℃高壓 30分鐘滅菌，烘干備用。
（18）耐高溫的實驗沖洗瓶、孵育盒、醫(yī)用塑料片架均購自福州邁新公司。
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二、結果 
正常結直腸構造粘膜上皮呈單層柱狀，由柱狀細胞核杯狀細胞構成，細胞巨細均一、分列劃一，固有層內(nèi)含有大量由上皮下陷而成的結直腸腺瘤，呈單管狀，布局劃一完備；結直腸高分解腺癌：低倍鏡見細胞多分列成巨細紛歧，形態(tài)不等的腺管狀，有的呈乳頭狀，有的擴張呈小囊腔狀。高倍鏡可見癌細胞呈高柱狀，巨細紛歧，分列混亂，多為復層，失去極性，核巨細紛歧，濃染。癌細胞分列呈大的管腔樣，不規(guī)整，腔內(nèi)可見有壞去世脫落的癌細胞；結直腸低分解腺癌：癌構造無完備腺腔樣布局，癌細胞分列呈條索狀或片狀，癌細胞小，異型性顯著，核破裂較多；CRC 中分解腺癌：癌構造多數(shù)（>50%）呈腺管樣分列，管腔形狀不規(guī)矩、巨細紛歧，少部門癌構造可呈實性條索狀或巢狀分列，細胞核分列亂七八糟。
c-Met 蛋白的陽性表達主要表現(xiàn)為細胞膜上出現(xiàn)棕黃色彌漫性染色或棕黃色顆粒，細胞核未見著色。按照腫瘤細胞漿及細胞膜染色評分標準分別進行評分。如圖 A-D 所示：圖 A1-2 為正常結直腸粘膜；圖 B1-2 為 CRC 組織；圖 C1-2為 CRC 轉移淋巴結；圖 D1-2 為 CRC 肝轉移灶。
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第二章 結直腸癌組織 c-Met mRNA 的表達水平.................... 57-83 
一、 材料與方法............................ 57-72 
二、 結果....................... 72-75 
三、 討論 ...................75-79 
四、 結論.................... 79-80 
五、 參考文獻 ..........................80-83 
第三章 c-Met 蛋白表達與結直腸癌肝轉移關系的多因素分析 .......................................83-113 
一、 材料與方法 ....................83-94 
二、 結果 ....................94-106 
三、 討論........................................... 106-109 
四、 結論 .................................109-110 
五、 參考文獻 ...............................110-113 

第四章 c-Met 與 VEGF 的血清的檢測分析

一、材料與方法 
1 實驗的材料及選擇
1.1 納入病例
所納入 CRC 患者及對照組均來自廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院。選擇時間段為 2011 年 6 月-2012 年 6 月。CRC 患者來自廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科，診斷為 CRC 的住院患者 115 例，其中男性 83 例，女性 32 例，年齡29-71 歲，中位年齡 54 歲。按分化程度分為：低分化腺癌 84 例，中分化腺癌22 例，高分化腺癌 9 例。根據(jù)臨床分期：I 期 6 例，II 期 37 例（I+II 期 43 例），III 期 51 例，IV 期 21 例（III+IV 期 72 例）。選擇同期在廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院門診健康體檢者作為對照組（共計 108 例）。其中男性 67 例，女性 41例，年齡 30-70 歲，中位年齡 49 歲。所有納入人員均無糖尿病、心臟病、高血壓等其他疾病，血清學檢測 HIV、HCV 等均為陰性。采血前 CRC 患者未經(jīng)任何治療，所有 CRC 患者均為病理證實，所有 CRC 遠處轉移患者均選取肝轉移患者，若合并其他部位轉移者予以剔除。體檢者未采取任何干預。所有納入人員均簽訂知情同意書。
1.2 血清的采樣
所有 CRC 患者和對照健康人群均為晨起空腹時取血，每例均采取 10ml的外周靜脈血，靜置于 10℃以下，待 500rpm 離心 15 分鐘后，上清分裝到凍存的試管中，-70℃保存，備用。
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總結

c-Met 蛋白的異常高表達伴隨著 CRC 疾病進展的各個階段，c-Met 蛋白在CRC 的發(fā)生發(fā)展和轉移侵襲中可能起著重要作用。當 c-Met 蛋白高表達時，筆耕文化傳播，可能預示著CRC的進展程度及惡性程度，也可能是CRC肝轉移的危險因素之一。檢測 c-Met 蛋白的表達水平有可能為評價 CRC 的生物學行為趨勢提供較有價值的參考依據(jù)。
對于外科的初治病人，鑒于行 CRC 根治手術時可能已存在微轉移的可能，及時針對 CRC 原發(fā)瘤及淋巴結進行 c-Met 蛋白表達的檢測和評估，若 c-Met蛋白陽性表達，其發(fā)生肝轉移的風險分別是 c-Met 蛋白陰性表達的 1.678 倍、1.728 倍。分選出術后復發(fā)及肝轉移的高危人群，并對其進行密切隨訪，根據(jù)具體情況，盡早對其進行相應的干預治療，可能是當前 CRC 術后預防復發(fā)、轉移的有效補充。
c-Met 蛋白、c-Met mRNA 表達水平升高具有同步性，當發(fā)生 CRC 肝轉移時，陽性轉移淋巴結、肝轉移灶 c-Met mRNA 的表達也顯著增加。CRC 患者血清c-Met、VEGF水平隨著臨床分期增高而逐漸增高。CRC患者c-Met與VEGF血清水平呈正相關。對 CRC 患者進行 c-Met 的血清檢測，可能可以作為 CRC患者診斷和術后監(jiān)控的手段之一。
然而，由于實驗時間較短，實驗室設備、條件，資金等多方面因素的限制，本次實驗設計僅限于 CRC 臨床樣本的 c-Met 的檢測，未能從相關機制上完全闡明 HGF/c-Met 信號通路的作用機制，難以根本上求證 c-Met 與 CRC 惡性程度和轉移相關的可能機制，這對于本文中的結論說服力有一定限制。但由于檢測樣本量較大，統(tǒng)計學處理得當，結果可靠。
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參考文獻:

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本文編號：10878