發(fā)布時間：2017-11-26 12:00

  本文關鍵詞：微囊藻毒素-LR對HepG2細胞腫瘤相關基因表達的影響

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【摘要】：微囊藻毒素(microcytstins,MCs)是由藍藻產(chǎn)生的且具有肝毒性的小肽內毒素,可誘發(fā)肝炎并促發(fā)肝癌,對易感人群健康存在極大威脅。本實驗通過研究MCs對人肝癌細胞HepG2肝癌相關的原癌基因及抑癌基因表達的影響,探討該毒素誘導肝炎/肝癌的機理,為毒素暴露人群健康的防護提供理論支撐。本研究采用常規(guī)細胞毒性實驗方法,用純毒素MC-LR對HepG2細胞進行染毒處理,MTT法檢測細胞活力,以確定該毒素的細胞毒性。根據(jù)細胞毒性及其細胞活力實驗結果,我們選擇MC-LR的非細胞毒染毒濃度為0 n M、10 n M、50 n M、0.5μM、10μM、50μM;染毒時間分別為8 h、24 h、48 h和72 h。細胞染毒處理結束后,收集HepG2細胞、提取總RNA并進行逆轉錄PCR;然后用q PCR檢測與肝癌相關的原癌基因c-Met、c-fos、c-jun、c-myc、N-ras及抑癌基因PTEN轉錄水平的表達情況。同時,采用Western blot方法檢測上述基因蛋白水平的表達。本研究所獲得的主要實驗結果有如下3個方面。1.MTT檢測結果和MC-LR的細胞毒性用MC-LR處理HepG2細胞8 h、24 h時,MTT檢測發(fā)現(xiàn),染毒組和對照組之間對比發(fā)現(xiàn)細胞活力無統(tǒng)計學差異。處理48 h時(除100μM組)染毒組細胞活性雖有所降低,但與對照組相比仍無明顯差別。僅100μM MC-LR暴露48 h后,細胞活力與對照組相比顯著下降。2.MC-LR對HepG2細胞原癌基因及抑癌基因轉錄水平表達的影響HepG2細胞經(jīng)MC-LR染毒處理后,qPCR檢測發(fā)現(xiàn),原癌基因c-Met的相對表達量(m RNA水平)隨MC-LR處理劑量的增加及處理時間的延長而顯著上升,且高濃度組較低濃度組上升更明顯。該實驗結果說明,MC-LR染毒明顯促進HepG2細胞中原癌基因c-Met的表達。原癌基因c-fos轉錄水平經(jīng)MC-LR染毒8 h時即明顯上調,且均達到最高峰。染毒24 h、48 h和72 h時,上調情況有所下降。因此,MC-LR染毒也明顯促進HepG2細胞原癌基因c-fos的表達,而且染毒濃度越高,促進作用越明顯。原癌基因c-jun的mRNA水平在MC-LR處理8 h時,各濃度組和對照組相比均顯著上升,并且隨著染毒劑量的加大而升高。處理24 h時持續(xù)上調但高濃度組相對于低濃度組升高更為明顯,且各染毒組均上調到最高峰。48 h和72 h各濃度組仍然上調,但上調幅度下降。該實驗結果說明,MC-LR染毒明顯促進HepG2細胞中原癌基因c-jun的表達。MC-LR染毒8 h時,各濃度組細胞c-myc的轉錄水平均較對照組升高并達到最高峰。24 h、48 h和72 h時各濃度組c-myc表達仍顯著上升,但相對于8 h情況有所下降。因此,c-myc的表達隨著MC-LR暴露濃度的增加而顯著上調。和對照組相比,各濃度MC-LR組(除10 n M組)HepG2細胞N-ras的表達經(jīng)染毒8 h均顯著上調。24 h時繼續(xù)上調,48 h上調達到最高峰,72 h上調情況有所下降,且隨染毒濃度增加而加強。該實驗結果表明,MC-LR染毒明顯促進HepG2細胞中原癌基因N-ras的表達。MC-LR染毒后,HepG2細胞抑癌基因PTEN的表達情況比較復雜。處理8 h和24 h比對照組明顯下調,且高濃度組下調情況比低濃度組更為顯著。48 h時仍顯著下調,且0.5μM組、10μM組及50μM組下調達到最低水平。72 h時50 n M組、0.5μM組、10μM組及50μM組,表達均顯著下調。該檢測結果表明,MC-LR染毒明顯抑制PTEN的表達。3.MC-LR對HepG2細胞中原癌基因及抑癌基因蛋白表達水平的影響Western blot檢測結果表明,MC-LR染毒處理上調原癌基因c-Met、c-Fos、c-Jun、c-Myc及N-Ras的蛋白水平,但下調PTEN的蛋白水平。該結果與MC-LR對其轉錄的影響結果一致。本實驗結果說明,采用非細胞毒濃度的MC-LR染毒HepG2細胞后,極低劑量的MC-LR能分別于轉錄及蛋白水平上調原癌基因表達且下調抑癌基因表達。該結果不僅說明HepG2細胞肝癌相關原癌基因及抑癌基因與MC-LR肝細胞毒性密切相關,而且在基因表達水平說明MC-LR引發(fā)肝炎/肝癌可能與該毒素誘導的原癌基因過表達及抑癌基因的表達抑制存在緊密聯(lián)系。本研究結果對于揭示MC-LR所致肝炎/肝癌的機理及保護毒素暴露人群的健康具有一定的理論意義。
【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：X52;R730.2

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本文編號：1229692