異環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺為同分異構(gòu)體，為常用的化療藥物，抗癌譜相似，廣泛用于治療常見惡性腫瘤。異環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺血藥濃度的測定方法主要是高效液相色譜法，方法樣品的預(yù)處理存在操作繁瑣、不穩(wěn)定、成本高等問題。本研究在氯仿萃取方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，建立HPLC法測定異環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺血藥濃度，以便更好地滿足臨床人體血藥濃度檢測及藥代動力學(xué)研究的要求。

　　1 材 料

　　1．1 儀器：LC一10A高效液相色譜儀(日本島津公司)，包括LC-10AT vP高壓泵，SPD-10A VP紫外檢測器，LC一10ATVP柱溫箱，威瑪通用色譜數(shù)據(jù)工作站。

　　1．2 試藥：環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，含量>

　　99．5%，批號20070602)；異環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，含量>99．5%，批號20070801)；乙晴為色譜純；氯仿、無水硫酸鈉均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為雙重蒸餾水。

　　2 方法與結(jié)果

　　2．1 對照品和內(nèi)標(biāo)溶液的配制：分別精密稱取異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺對照品5O．00mg，分別置于50 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至亥 度，得濃度均為1 000 mg·L 環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺對照品儲備液，于冰箱4℃ 保存。用流動相分別稀釋異環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺儲備液至250 mg·L 作內(nèi)標(biāo)工作液；用流動相分別稀釋異環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺儲備液至500．0，250．0，100．0，5O．0，25．0，10．0，5．0 mg·L 作異環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺工作液；另用流動相分別稀釋異環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺儲備液至250，125，12．5 mg·L 作質(zhì)控溶液；于冰箱4℃ 保存。

　　2．2 色譜條件：色譜柱：Zorbax-ODS Cl8(4．6 mm× 250mm，5m)，柱溫：室溫。流動相：乙晴水(25：75)，流速1．0 mL·min一，檢測波長；200 nm，進(jìn)樣量為2O L。在此條件下異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺的出峰時間約為11．16 min與12．31 min。

　　2．3 樣品預(yù)處理：取5 mL試管，加入1．5 g的無水硫酸鈉，精確吸取250 L血漿樣品于試管中，精確加入內(nèi)標(biāo)液(250 mg·L 環(huán)磷酰胺或250 mg·L 異環(huán)磷酰胺20 L)，放置2 min，待無水硫酸鈉將血漿吸附完全后，用2．0，1．0 mL氯仿提取，合并提取液，水浴5O ℃ 通氮吹干，用100 L流動相溶解，離心5 min(15 000 r·min )，取上清液2OL進(jìn)樣。

　　2．4 方法專屬性考察：取250 L空白血漿分別加入2O L濃度為250 mg·L 環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺工作液，依2．3方法操作，取上清液2O L進(jìn)樣測定，異環(huán)磷酰胺的保留時間為11．16 min，環(huán)磷酰胺保留時間為12．31 min。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標(biāo)物的測定，結(jié)果見圖1。

　　2．5 線性范圍和檢出限：取健康人空白血漿，加入異環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺工作液，配制異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺濃度分別為1．0，5．0，10．0，25．0，50．0，100．0，200．0 mg·L 血漿樣品，按2．3方法操作。以異環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(Y)對異環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺的濃度(X)進(jìn)行線性回歸。異環(huán)磷酰胺回歸方程為y一0．018X+0．015(r一0．999 8，一7)，血漿中異環(huán)磷酰胺濃度在1．0～200 mg·L。范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；環(huán)磷酰胺回歸方程為Y-二0．020X+0．014(r一0．999 9， 一7)，血漿中環(huán)磷酰胺濃度在1．0～200mg·L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。在此色譜條件下，以信噪比(S／N)為3，此方法血漿中異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺的最低檢出限分別為0．2o mg·L 和0．25 mg·L～。A：空白血漿；B：空白血漿+ 異環(huán)磷酰胺(20 mg·L )+環(huán)磷酰胺(20 mg·L )；C：病人A環(huán)磷酰胺血藥濃度；D：病人B異環(huán)磷酰胺血藥濃度；1：異環(huán)磷酰胺；2：環(huán)磷酰胺

　　2．6 提取回收率：取健康人空白血漿，分別加入異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺工作液，配制異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺濃度分別為5．0，50．0，100．0 mg·L。血漿樣品，每個濃度5份，按2．3方法操作，記錄峰面積；另取12．5，125．0，250．0 mg·L。低、中、高3個濃度異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺質(zhì)控溶液直接進(jìn)樣分析，記錄峰面積，將血樣中峰面積與相應(yīng)質(zhì)控溶液峰面積相比，計算提取回收率。

　　2．7 精密度和相對回收率：取健康人空白血漿，分別加入異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺工作液，配制異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺濃度分別為5．0，50．0，100．0 mg·L 血漿樣品，每個濃度5份，按2．3方法操作，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血樣中異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺的濃度，計算相對回收率，同日內(nèi)每種濃度的樣品平行操作5次和每天1次連續(xù)考察5 d，分別計算方法的日內(nèi)、日間精密度。

　　2．8 穩(wěn)定性考察

　　2．8．1 儲備液的穩(wěn)定性考察：取異環(huán)磷酰胺及環(huán)磷酰胺質(zhì)控溶液在1，7，1 5，30，45，60 d直接進(jìn)樣2OL，記錄峰面積。

　　結(jié)果：異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺的峰面積的RSD分別為1．5%，1．3%，表明異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺至少在60 d內(nèi)穩(wěn)定。

　　2．8．2 血漿樣品存放期間的穩(wěn)定性考察：取健康人空白血漿數(shù)份，加入異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺工作液，配成濃度為50．0mg·L 血漿樣品，放置20℃冰箱中，反復(fù)凍融6次，處理后進(jìn)樣，考察其凍融穩(wěn)定性，結(jié)果：異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺峰面積RSD分別為3．0%、2．8%。另外在第0，5，10，20，30天時取樣分析，考察存放期間的穩(wěn)定性，結(jié)果，異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺峰面積RSD分別為2．7%、2．5%。表明含異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺血漿在一2O℃ 冰箱中30 d是穩(wěn)定的。

　　2．9 方法應(yīng)用：病人A，女，4O歲。人院診斷為食道淋巴瘤，收住于本院化療科，按醫(yī)囑于2008年8月10日靜脈推注環(huán)磷酰胺1 g，用藥6 h后，抽取病人前臂靜脈血樣，測定環(huán)磷酰胺血藥濃度為8．01 mg·l。病人B，男，16歲。入院診斷為左脛骨上段骨肉瘤，收住于本院化療科。按醫(yī)囑于2008年8月10日用異環(huán)磷酰胺5 g化療，靜脈滴注3 h，結(jié)束后6 h抽取病人前臂靜脈血樣，筆耕論文新浪博客，測定異環(huán)磷酰胺血藥濃度為44．48 mg·L。提示建立的檢測方法準(zhǔn)確、快速，適用于異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺血藥濃度監(jiān)測。

　　3 討 論文獻(xiàn)報道測定異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺血藥濃度樣品預(yù)處理方法有采用固相萃取小柱萃取、氯仿萃取以及有用甲醇沉淀等方法。固相萃取小柱成本高，不利于大樣本量的使用；甲醇沉淀方法使樣本體積增大，方法靈敏度降低，難以滿足低血藥濃度的檢測要求，考察用氯仿提取方法，發(fā)現(xiàn)提取過程出現(xiàn)大量乳化現(xiàn)象，氯仿處于下層，吸取操作不方便，試驗(yàn)結(jié)果圖譜雜質(zhì)多，色譜峰分離不理想，回收率不穩(wěn)定。我們采用無水硫酸鈉將血漿樣品中異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺脫水吸附，再用氯仿將異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺從硫酸鈉中提取，該提取方法將液一液提取轉(zhuǎn)化為液 固提取，由于氯仿位于上層，操作方法簡單，快捷、避免乳化，試驗(yàn)結(jié)果回收率高且穩(wěn)定，許多雜質(zhì)吸附在硫酸鈉中，因此，試驗(yàn)結(jié)果圖譜雜質(zhì)少、色譜峰分離理想。

　　本試驗(yàn)建立的方法所需樣本數(shù)少，樣品處理簡便、快速、靈敏度高，同時適用于異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺血藥濃度監(jiān)測及藥代動力學(xué)研究。

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