【摘要】：本研究以秦巴山區(qū)野生中藥材重樓,又名七葉一枝花Paris polyphylla var.chinensis(Franch.)Hara為供試材料,通過乙醇回流提取皂苷,經分離純化工藝制備樣品;利用流動注射-化學發(fā)光(CL-FIA)分析技術,構建了重樓皂苷類化合物和重樓皂苷Ⅰ單體的分析檢測方法。通過條件及參數優(yōu)化,方法學驗證和干擾試驗;并結合HPLC和UV分析結果比較,考察了CL-FIA的靈敏度和可行性。主要研究內容和實驗結果分述如下。(1)在重樓皂苷類提取的單因素試驗基礎之上,采用響應面法優(yōu)化重樓皂苷類的提取工藝;同時,利用大孔吸附樹脂對重樓皂苷成分進行純化。在優(yōu)化最佳條件下,通過HPLC或UV檢測分析結果顯示,樣品中重樓皂苷類化合物含量分別為21.938mg·g~(-1)和22.192mg·g~(-1)。此外,在提取純化重樓皂苷的基礎上,采用硅膠柱層析技術分離獲得重樓皂苷Ⅰ單體成分,HPLC分析檢測表明,皂苷Ⅰ含量為2.068~2.098mg·g~(-1)之間,其純度為95.40%。分析結果表明,所構建的重樓皂苷提純方法和皂苷Ⅰ單體的分離工藝條件可行,從而為后續(xù)重樓皂苷類成分的CL-FIA分析研究奠定了基礎。此外,通過HPLC對15批來源不同的市售重樓藥材樣品,對7種皂苷類化合物的含量進行了分析,構建了HPLC指紋圖譜。結果表明,測定的樣品中甾體皂苷種類和含量差異較大,品質良莠不齊。(2)試驗研究表明,在Luminol-H_2O_2體系中,H_2O_2通過氧化Luminol產生較弱強度的化學發(fā)光,但加入Cu2+后對該化學發(fā)光強度有增敏作用;在該體系中加入重樓皂苷后,可明顯抑制化學發(fā)光。在酸性介質中,重樓皂苷對KMnO4-Luminol體系的化學發(fā)光有明顯的抑制作用。據此,基于Luminol-H_2O_2和KMnO4-Luminol化學發(fā)光體系,構建了重樓皂苷的CL-FIA分析檢測方法。試驗分別以重樓皂苷Ⅶ、Ⅰ和薯蕷皂苷為標品,開展了對比檢測。在優(yōu)化的條件下,Luminol-H_2O_2體系中,3種標品對該體系的線性范圍分別是0.305~3.050μg·mL~(-1),0.308~3.080μg·mL~(-1)和0.311~3.110μg·mL~(-1);檢出限分別為0.202μg·mL~(-1),0.224μg·mL~(-1)和0.215μg·mL~(-1);測定樣品中重樓皂苷化合物的含量為21.003mg·g~(-1),RSD≤1.68%。在KMnO4-Luminol體系中,3種標品對該體系的線性范圍分別是0.140~2.330μg·mL~(-1),0.142~2.353μg·mL~(-1)和0.144~2.376μg·m L~(-1);檢出限分別為0.102μg·mL~(-1),0.135μg·m L~(-1)和0.125μg·mL~(-1),測定樣品中重樓皂苷化合物的含量為21.248mg·g~(-1),RSD≤1.78%。采用以上2種體系,分別以3種標準品開展平行分析檢測,其結果無明顯差異;通過建立的體系與方法,對標品溶液平行檢測11次,RSD均小于2.98%,表明精密度良好。比較CL-FIA與HPLC或UV對重樓皂苷的測定結果表明,3種不同分析檢測方法的測定結果基本一致,討論了方法的可行性和可靠性。此外,2種發(fā)光檢測體系精確度的比較顯示,KMnO4-Luminol-H+體系的檢測范圍較寬、其檢出限更低、靈敏度較高。(3)通過對化學發(fā)光體系的配體、反應介質種類、介質濃度和儀器參數等因素的試驗考察,篩選出2種化學發(fā)光體系可用于測定重樓皂苷Ⅰ單體的CL-FIA方法,同時探討了方法的可行性。在不同的介質條件下,重樓皂苷Ⅰ對Ce(Ⅳ)-羅丹明6G體系的發(fā)光強度有較大的增強作用,而對Luminol-NaIO4發(fā)光體系則有明顯的抑制作用。在優(yōu)化反應條件下,2種體系的線性范圍分別為1.275~4.250μg·mL~(-1)和0.855~4.250μg·mL~(-1);檢出限分別為0.793μg·mL~(-1)和0.697μg·mL~(-1);基于2種體系對樣品中重樓皂苷Ⅰ的分析檢測,其含量分別為1.938mg·g~(-1)和1.956mg·g~(-1)。綜合比較分析表明,2種化學發(fā)光檢測體系,Luminol-NaIO4體系對重樓皂苷Ⅰ的檢測結果相對令人滿意;但CL-FIA測定重樓皂苷Ⅰ的精確性略低于HPLC。研究表明,CL-FIA檢測結果的影響因素較多,其中發(fā)光劑和氧化劑的影響作用比較顯著。不同化學發(fā)光體系、不同系統(tǒng)設定參數、不同組分濃度等多方面,均會影響樣品的檢測結果。所以,針對不同藥材或藥材的不同活性成分的測定,篩選適宜的化學發(fā)光體系是構建CL-FIA方法的關鍵所在;其次,其精確性和靈敏度與反應介質的種類、濃度以及儀器參數等的設定與優(yōu)化也有一定的關系。通過縱橫向比較分析,研究結果表明,本實驗所建立的流動注射-化學發(fā)光分析檢測重樓皂苷成分的方法,其精確度比UV或HPLC略低。但CL-FIA方法具有線性范圍寬,檢測限低,分析速度快,實驗成本較低等優(yōu)點,故該方法為重樓藥材的品質分析、皂苷類成分的檢測或質控方面提供了另一依據和途徑。
【學位授予單位】：陜西理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R284.1
【圖文】：

計算重樓皂苷Ⅶ、H、Ⅵ、3.0%。率% =加標試樣測定值-試樣測定值加標量曲線的建立立別精密吸取對照品溶液，于 0.05，0.1，揮干，再依次加入 10.0 mL 高氯酸后冷水浴至室溫，以甲醇溶液為空白對照值(Y) 為縱坐標，重樓皂苷Ⅶ濃度(X，為 Y = 0.0412X－0.0016, R2= 0.9975。00μg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性

加甲醇定容，然后用 0.22μm 濾膜過濾，依次進樣 20.0μL 進行色譜分析，定峰面積。分別以各色譜峰面積(Y)為縱坐標，以對照品質量濃度(X)為橫坐標，進線性回歸，繪制標準曲線。保留時間、線性回歸方程、相關系數和線性范圍(表 2表 2-1 重樓對照品線性回歸方程及相關系數Table 2-1 Regression equation and rorrelation coefficient of reference substances solution重樓皂苷成分 保留時間/min 線性回歸方程 R2線性范圍/μg·m重樓皂苷Ⅶ 3.50 Y=5129.7X+158933.1 0.9991 9.2-184重樓皂苷 H 4.22 Y=7929.6X+201886 0.9994 9.6-192重樓皂苷Ⅵ 4.86 Y=13422X+65055 0.9990 9.2-184重樓皂苷Ⅱ 7.95 Y=5628.4X+19827 0.9991 12.8-256薯蕷皂苷 9.47 Y=6265.1X+18166 0.9994 8.7-174重樓皂苷Ⅰ 10.57 Y=6708.5X+40102 0.9993 9.2-184重樓皂苷 V 13.24 Y=6875.7X+44.6 0.9995 9.4-188

表 2-2 提取溶劑對皂苷得率的影響Tab. 2-3 Effect of extraction solvent on yield取劑30%乙醇 50%乙醇 70%乙醇 90%乙醇 100%乙醇 50%甲醇 100%甲醇率/%1.601 1.792 1.854 1.790 1.715 1.688 1.715(2) 提取前浸泡時間固定提取溶劑(70%乙醇)，固定液料比 30:1(mL:g)，水浴提取溫度(85℃)，提取時(60min·次-1)及提取次數(1 次)，分別考察在溶劑中冷浸時間為 30，60，90，120 和0min 的提取效果。結果表明，選擇浸泡時間為 90min 較為適宜(圖 2-3)。(3) 液料比固定提取溶劑(70%乙醇)，其它條件同(1)項，考察液料比為 10:1，20:1，30:1，:1，50:1 和 60:1(mL:g)對重樓皂苷得率的影響。結果表明，選擇液料比為 40:1(mL:g)，果最佳(圖 2-4)。

【參考文獻】

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本文編號：2744511