發(fā)布時(shí)間：2020-07-07 01:22

【摘要】：第一部分條件培養(yǎng)基的制備及其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)生物學(xué)功能的影響目的:體外培養(yǎng)MH7A,建立腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)誘導(dǎo)MH7A炎癥損傷模型,制備來自MH7A的條件培養(yǎng)基。確定MH7A條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)HUVEC的適宜濃度,并觀察MH7A條件培養(yǎng)基對(duì)HUVEC生物學(xué)功能的影響及其產(chǎn)生作用的機(jī)制。方法:MH7A體外成功培養(yǎng)后,用濃度為2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL的TNF-α作用促進(jìn)其增殖。CCK-8法檢測(cè)TNF-α作用后MH7A的增殖活性以確定適宜的造模濃度。造模24 h后,提取MH7A培養(yǎng)液,并且從澄清度、無菌、pH值等方面對(duì)提取的培養(yǎng)液進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。HUVEC體外成功培養(yǎng)后,HUVEC經(jīng)過不同濃度MH7A條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)后,CCK-8法檢測(cè)不同組HUVEC增殖活性以確定MH7A條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)HUVEC的適宜濃度。采用條件培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組誘導(dǎo)24 h,采用CCK-8法、細(xì)胞劃痕、細(xì)胞遷移法觀察HUVEC增殖和遷移活性的變化,ELISA法檢測(cè)HUVEC上清中血管緊張素-1(Angiotensin,Ang-1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor,FGF)和血管抑素(Angiostatin,AS)分泌量、蛋白質(zhì)電泳法(Western-blot)法和RT-qPCR檢測(cè)HUVEC中S1P-S1PR1及其下游RhoA-F-actin-NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白S1PR1、RhoA、F-actin、NF-κB p65等的蛋白及mRNA表達(dá)量。結(jié)果:濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的TNF-α均都能誘導(dǎo)MH7A增殖,10 ng/mL的TNF-α為造模的適宜濃度。提取的培養(yǎng)基為粉紅色的澄清透明溶液,無菌、pH值為7.28±0.12,該溶液pH在多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的適宜值(7.2-7.4)。CCK-8結(jié)果證明MH7A條件培養(yǎng)基原液、二倍及四倍稀釋液均能誘導(dǎo)HUVEC增殖,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)部分均采用MH7A條件培養(yǎng)基原液作為刺激物。經(jīng)MH7A條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)后,HUVEC增殖和遷移能力顯著增加。HUVEC中促血管生成因子Ang-1、FGF分泌量升高,抑血管生成因子AS分泌水平下降,使促/抑血管生成因子動(dòng)態(tài)平衡向促進(jìn)血管新生方向移動(dòng)。Western blot法檢測(cè)S1PR1、RhoA、F-actin、NF-κB p65和NF-κB p-p65的蛋白表達(dá)量均上升。RT-qPCR檢測(cè)HUVEC中S1PR1、RhoA、F-actin和NF-κB p65的mRNA表達(dá)量明顯增加。結(jié)論:成功制備來自于MH7A的符合細(xì)胞培養(yǎng)基本要求的條件培養(yǎng)基。來自MH7A的條件培養(yǎng)基可成功誘導(dǎo)HUVEC增殖和遷移。MH7A條件培養(yǎng)基具有促進(jìn)HUVEC血管新生的作用,其作用機(jī)制是通過活化S1P-S1PR1及其下游RhoA-F-actin-NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。第二部分梔子苷(Geniposide,GE)對(duì)MH7A條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC生物學(xué)功能改變的治療作用目的:探討經(jīng)GE給藥后對(duì)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC生物學(xué)功能改變的治療作用及其作用機(jī)制。方法:HUVEC經(jīng)MH7A條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)24 h,加入濃度為6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的GE溶液作用24 h后,CCK-8法檢測(cè)HUVEC的增殖活性以確定GE適宜給藥濃度。采用細(xì)胞劃痕、細(xì)胞遷移法觀察給藥后HUVEC遷移能力的變化,ELISA法檢測(cè)HUVEC上清中Ang-1、FGF和AS分泌量、熒光染色法觀察HUVEC中F-actin的形態(tài)和分布、Western-blot法和RT-q PCR檢測(cè)MH7A條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC中S1P-S1PR1及其下游Rho A-F-actin-NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白S1PR1、Rho A、F-actin及NF-κB p65的蛋白表達(dá)量及RNA表達(dá)量。結(jié)果:經(jīng)GE給藥后,HUVEC的異常增殖反應(yīng)得到抑制,且濃度為25μM、50μM、100μM的GE溶液作用較為顯著。故以上三個(gè)劑量被用于之后的實(shí)驗(yàn)。且HUVEC增加的增殖活性和遷移能力均被GE顯著抑制。HUVEC中失去動(dòng)態(tài)平衡的促/抑血管生成因子得到改善,不同程度下調(diào)促血管生成因子Ang-1和FGF水平,上調(diào)抑血管生成因子AS水平。Western blot和RT-q PCR法檢測(cè)S1PR1、Rho A、F-actin及NF-κB p65上升的蛋白和m RNA表達(dá)量均明顯下調(diào)。結(jié)論:GE明顯改善MH7A條件培養(yǎng)基對(duì)HUVEC的誘導(dǎo)作用,并且其作用機(jī)制是通過抑制S1P-S1PR1和下游RhoA-F-actin-NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的,這些新的發(fā)現(xiàn)有助于我們進(jìn)一步闡明GE在抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血管新生和細(xì)胞骨架重組等方面的作用機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

調(diào)控 S1P-S1PR1 及其下游 RhoA-F-actin-NF-κB 信號(hào)通路干預(yù)成纖維滑膜細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮學(xué)功能影響t = (Ct,gene1-Ct,GAPDH) sample1 - (Ct,gene1-Ct,GAPDH) sample2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 SPSS 23.0 軟件處理數(shù)據(jù)，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean SD）表示量平均值，組間差異采用 t 檢驗(yàn)，p<0.05 表示組間具有顯著性差異。驗(yàn)結(jié)果不同濃度 TNF-α對(duì) MH7A 增殖的影響以每孔 5×103的細(xì)胞密度將 MH7A 接種于 96 孔培養(yǎng)板中，為了確定的適宜濃度，用濃度為 2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40F-α誘導(dǎo) MH7A，CCK-8 試劑檢測(cè) MH7A 的增殖活性。結(jié)果表明，5 /mL、20 ng/mL 的 TNF-α溶液均能促進(jìn) MH7A 增殖，后續(xù)選擇的造為 10 ng/mL（圖 1）。

的制備及其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endo生物學(xué)功能的影響的條件培養(yǎng)基可以滿足細(xì)胞培養(yǎng)所需的基本條件為之后繼續(xù)觀察 MH7A 條件培養(yǎng)基能否影響 H其治療作用創(chuàng)造了條件�；�中 S1P 含量的測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)上清于離心管，以 1800 rpm 的轉(zhuǎn)速離1P 活性的檢測(cè)。如圖 2，與正常組相比，模型組著增高，結(jié)果證明炎性環(huán)境可以明顯增加 MH7。

H7A 條件培養(yǎng)基對(duì) HUVEC 細(xì)胞劃痕的影響胞劃痕法檢測(cè) HUVEC 遷移能力。將 HUVEC 制成濃度為于六孔板內(nèi)，待 HUVEC 鋪滿底部時(shí)，用滅菌的 200μL 的痕，使細(xì)胞間形成刮溝，用 PBS 沖洗掉滑落細(xì)胞后，加少下拍照，記為 0 h。加入 MH7A 條件培養(yǎng)基或正常培養(yǎng)基后微鏡下拍照，記為 24 h。細(xì)胞遷移能力的大小用劃痕寬度度變化程度愈大，則表示細(xì)胞遷移能力愈強(qiáng)。模型組 HUV明顯高于空白組，這表明 MH7A 條件培養(yǎng)基可顯著誘導(dǎo) 力。圖 3 不同濃度的 MH7A 條件培養(yǎng)基對(duì) HUVEC 增殖能力的影響Fig. 3 Proliferation of HUVEC treated by TNF-α##P<0.01 vs Ctr (mean±SD，n=6)

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7 昌建

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