發(fā)布時(shí)間：2020-07-04 23:42

【摘要】：研究背景近年來(lái)隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們生活方式發(fā)生了較大的變化,大量高能量、高脂和高糖食物的攝入使得高脂血癥的發(fā)病率逐年增高并伴有低齡化趨勢(shì),高脂血癥是血清中的膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量過(guò)高和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平過(guò)低的一種脂代謝紊亂性疾病,若不進(jìn)行有效干預(yù),可成為誘發(fā)高血壓、高血黏度、脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化甚至冠心病及腦卒中等一系列嚴(yán)重疾病的危險(xiǎn)因素。目前市場(chǎng)上治療高脂血癥的藥物主要是他汀和貝特類,其不良反應(yīng)對(duì)患者影響嚴(yán)重,因此尋找安全、有效、低毒的新型調(diào)脂藥物具有十分重要的應(yīng)用前景,也成為了醫(yī)藥學(xué)界的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中的脈抒(Maishu,MS)是一種天然產(chǎn)物組合物,主要原料為山楂、沙棘和枸杞等。IMM-H007是在天然產(chǎn)物蟲草素結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行改造篩選出的具有顯著調(diào)血脂活性的新型AMPK激動(dòng)劑,目前處于臨床前開發(fā)階段。本實(shí)驗(yàn)主要觀察這兩種受試品對(duì)實(shí)驗(yàn)性脂代謝紊亂和受累器官損害的保護(hù)作用。研究目的本研究主要觀察脈抒和IMM-H007對(duì)實(shí)驗(yàn)性脂代謝紊亂和受累器官的影響。研究方法(1)高脂膳食誘導(dǎo)高脂血癥金黃地鼠模型,給予不同劑量脈抒(低劑量:1 g/kg,中劑量:2 g/kg,高劑量:4 g/kg)、辛伐他汀(4 mg/kg)、非諾貝特(54mg/kg),每天灌胃給藥一次,觀察給藥2,4,8周后血清TC,TG,HDL-C,non-HDL-C 的變化;采用快速蛋白液相色譜(fast protein liquid chromatography,FPLC)技術(shù)分離給藥8周后血清中極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL),并檢測(cè)其所攜帶的-膽固醇含量;采用全自動(dòng)血液粘度儀檢測(cè)8周后全血血粘度值;采用離體微血管壓力直徑灌流系統(tǒng)觀察各組金黃地鼠腸系膜小動(dòng)脈對(duì)不同濃度梯度乙酰膽堿(Acetyl choline,Ach)誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的變化,評(píng)價(jià)脈抒對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響;測(cè)定肝臟TC,TG,計(jì)算肝指數(shù);制作肝臟病理切片,進(jìn)行HE和油紅O染色;應(yīng)用 western blot 方法檢測(cè) LDLR,HMGCR,SREBP2,CD36,SCD1 蛋白的表達(dá),探討脈抒對(duì)高脂血癥金黃地鼠脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的影響。(2)采用高脂喂養(yǎng)建立ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型,觀察口服不同劑量脈抒(低劑量:1 g/kg,中劑量:2 g/kg,高劑量:4 g/kg),阿托伐他汀(10 mg/kg),普羅布考(200 mg/kg)10周后ApoE-/-小鼠血脂水平的變化,每天灌胃給藥一次;分離主動(dòng)脈全長(zhǎng),采用油紅O染色,觀察主動(dòng)脈全長(zhǎng)斑塊形成;對(duì)主動(dòng)脈根部冰凍切片分別采用油紅O及天狼星紅染色,觀察主動(dòng)脈根部斑塊形成;采用動(dòng)態(tài)可視化微血管觀察系統(tǒng),觀察小鼠體內(nèi)白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附作用;用免疫組化方法檢測(cè)主動(dòng)脈根部斑塊中巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68表達(dá)變化。(3)高脂膳食誘導(dǎo)高脂血癥金黃地鼠模型,給予不同劑量IMM-H007(12.5 mg/kg,25 mg/kg,50 mg/kg,100 mg/kg,200 mg/kg),辛伐他汀(6 mg/kg),非諾貝特(50 mg/kg),每天灌胃給藥一次,連續(xù)給藥8周,在此期間,每周記錄動(dòng)物體重及攝食量。觀察給藥1,4,8周后血清TC,TG,LDL-C的變化;采用FPLC技術(shù)分離給藥8周后血清中VLDL,LDL,HDL,并檢測(cè)其所攜帶的膽固醇和甘油三酯-含量;測(cè)定肝臟TC,TG水平,計(jì)算肝指數(shù);制作肝臟石蠟切片做HE染色及冰凍切片油紅O染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)脈抒改善金黃地鼠脂代謝紊亂與正常對(duì)照組比,模型組血脂水平明顯升高;與模型組比,辛伐他汀(4 mg/kg)僅在給藥2周降低血清TC水平;辛伐他汀(4mg/kg)降低血清脂蛋白VLDL,LDL的膽固醇運(yùn)載量,不影響全血粘度、血管內(nèi)皮舒張功能、肝臟TC,TG含量及肝指數(shù),但減少肝臟脂質(zhì)沉積。與模型組比,非諾貝特(54 mg/kg)在給藥2周降低血清TC,TG,non-HDL-C水平,給藥4周僅降低TG水平,給藥8周對(duì)血脂無(wú)影響;非諾貝特(54 mg/kg)降低血清脂蛋白VLDL、LDL的膽固醇運(yùn)載量,不影響全血粘度、血管內(nèi)皮舒張功能,顯著降低肝臟TC,TG含量及肝指數(shù)和肝臟脂質(zhì)沉積。與模型組比,脈抒中、高劑量(2 g/kg,4 g/kg)在給藥2,4,8周均能明顯降低高脂血癥金黃地鼠血清TC含量,還可以顯著降低血清VLDL,LDL,HDL的膽固醇運(yùn)載量,并且能夠降低高脂血癥金黃地鼠肝組織TC,TG的含量,抑制肝指數(shù),改善中切和高切全血粘度;脈抒中劑量(2 g/kg)還可以改善高脂血癥金黃地鼠的血管內(nèi)皮舒張功能;脈抒可能通過(guò)抑制肝臟CD36,SCD1蛋白表達(dá),減少脂肪酸攝取和合成來(lái)改善高脂膳食引起的肝臟脂肪變性。(2)脈抒抑制ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成作用與正常對(duì)照組比,模型組血清血脂水平明顯升高;與模型組比,阿托伐他汀(10 mg/kg)不影響血脂水平、主動(dòng)脈根部斑塊面積和微循環(huán)中白細(xì)胞滾動(dòng)速率,降低主動(dòng)脈全長(zhǎng)斑塊與內(nèi)皮面積占比。天狼星紅染色顯示阿托伐他汀他汀(10 rng/kg)給藥組斑塊膠原纖維含量明顯較高,CD68免疫組化染色顯示主動(dòng)脈根部斑塊中巨噬細(xì)胞含量也明顯減少。與模型組比,普羅布考(200 mg/kg)降低血清TC水平、主動(dòng)脈全長(zhǎng)斑塊與內(nèi)皮面積占比和主動(dòng)脈根部斑塊面積,不影響微循環(huán)中白細(xì)胞滾動(dòng)速率。天狼星紅染色顯示,普羅布考(200 mg/kg)給藥組斑塊膠原纖維含量明顯較高,CD68免疫組化染色顯示,動(dòng)脈根部斑塊中巨噬細(xì)胞含量也明顯減少。與模型組比,脈抒高劑量(4 g/kg)降低血清TC水平,脈抒低、中、高劑量(1 g/kg,2 g/kg,4 g/kg)顯著降低apoE-/-小鼠血清TG水平;主動(dòng)脈全長(zhǎng)斑塊形成中,脈抒中、高劑量(2 g/kg,4 g/kg)條件下斑塊與內(nèi)皮面積占比均顯著降低;主動(dòng)脈根部冰凍切片發(fā)現(xiàn),脈抒中、高劑量(2g/kg,4g/kg)給藥組主動(dòng)脈根部斑塊面積顯著降低;脈抒高劑量(4 g/kg)給藥組微循環(huán)中白細(xì)胞滾動(dòng)速率顯著-增加;天狼星紅染色顯示,與模型組相比脈抒低、中(1 g/kg,2 g/kg)劑量給藥組斑塊膠原纖維含量明顯較高;CD68免疫組化染色顯示,脈抒給藥組主動(dòng)脈根部斑塊中巨噬細(xì)胞含量也明顯減少。(3)蟲草素衍生物IMM-H007改善金黃地鼠脂代謝紊亂與正常對(duì)照組比,模型組血清血脂水平明顯升高;與模型組比,辛伐他汀(6 mg/kg)給藥1周時(shí),不影響血脂水平,給藥4周時(shí),降低血清TC,TG,LDL-C水平,給藥8周時(shí)同樣降低血清TC,TG,LDL-C水平;辛伐他汀(50 mg/kg)降低脂蛋白VLDL所攜帶的膽固醇和甘油三酯含量及LDL所攜帶的甘油三酯含量;辛伐他汀(50 mg/kg)降低肝指數(shù),但未影響脂肪指數(shù)和肝臟TC,TG水平,可以改善高脂飲食引起的肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂和脂肪堆積情況。與模型組比,非諾貝特(50 mg/kg)給藥組動(dòng)物體重降低明顯,給藥1周時(shí),降低血清TC,LDL-C水平,給藥4周時(shí),降低血清TC,TG,LDL-C水平,給藥8周時(shí)同樣降低血清TC,TG,LDL-C水平;非諾貝特(50 mg/kg)降低脂蛋白VLDL,LDL所攜帶的膽固醇和甘油三酯水平;并且降低脂肪指數(shù)和肝臟TC,TC含量,增加肝指數(shù),明顯改善高脂飲食引起的肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂和脂肪堆積情況。與模型組比,IMM-H007不同劑量給藥組,不影響動(dòng)物體重和攝食;給藥1周時(shí),僅IMM-H007(200 mg/kg)降低血清LDL-C水平,給藥4周時(shí),IMM-H007(25 mg/kg,200 mg/kg)降低血清 TC,TG,LDL-C 水平,IMM-H007(100 mg/kg)降低血清 TG,LDL-C 水平,給藥 8 周時(shí),IMM-H007(100 mg/kg,200 mg/kg)降低血清TC,TG,LDL-C水平;分離出血清脂蛋白后,IMM-H007(200 mg/kg)降低VLDL及LDL的膽固醇和甘油三酯運(yùn)載量;IMM-H007不同劑量給藥組均可以降低肝指數(shù),但對(duì)脂肪指數(shù)無(wú)影響;IMM-H007(100 mg/kg,200mg/kg)降低肝臟TC,TG含量和明顯改善高脂飲食引起的肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂和脂肪堆積情況。結(jié)論(1)脈抒具有改善高脂膳食誘導(dǎo)的金黃地鼠血脂代謝紊亂和肝臟脂肪沉積的作用,可能是通過(guò)抑制肝臟CD36,SCD1蛋白表達(dá)減少脂質(zhì)沉積。(2)脈抒有效抑制apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型主動(dòng)脈斑塊形成,可能與其減少斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。(3)IMM-H007具有改善高脂膳食誘導(dǎo)的金黃地鼠血脂代謝紊亂和肝臟脂肪沉積的作用。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

與模型組比較，脈抒高、中劑量組（４邋ｇ／ｋｇ，邋２邋ｇ／ｋｇ）對(duì)高脂膳食引起的高脂逡逑血癥金黃地鼠肝臟ＨＭＧＣＲ，邋ＬＤＬＲ，邋ＳＲＥＢＰ２蛋白表達(dá)并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。逡逑見圖７。逡逑Ａ邐ＭＳ邋ＭＳ邐Ｂ邐１．０－ｊ邐□邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｍｏｄｅｌ邋ＮＩｉ（］（１｜ｅ邋，Ｉｊｇ｜）邐．邐ｔ邐■邋Ｍｏｄｔｌ逡逑Ｉ邐邐邐｜邐ｆ０８＇邐Ｃ３邋ＭＳ邋Ｍｉｄｄｌｅ逡逑瞧ｆｆ邋ｒｆｔｒ叫逡逑＾０４邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋｜邋Ｉ逡逑：：：ｃ邋＾ＪｌｌｌＵｌＵ逡逑圖７．脈抒不影響高脂血癥金黃地鼠肝臟膽固醇代謝相關(guān)蛋白ＳＲＥＢＰ２，邋ＬＤＬＲ，逡逑ＨＭＧＣＲ的表達(dá)。Ａ為具有代表性的一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果；Ｂ為Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ蛋白條帶逡逑信號(hào)密度值，每組取５個(gè)樣品混合后上樣，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（ｎ＝５）。逡逑３７逡逑

高（Ｐ＜邋０．０５，尸＜０．０５）；與模型組比，脈抒高、中劑量組金黃地鼠肝臟ＣＤ３６逡逑蛋白表達(dá)量降低（尸＜０．０５，Ｐ＜０．０５），另外，脈抒高、中劑量組（４ｇ／ｋｇ，２ｇ／ｋｇ）逡逑金黃地鼠肝臟ＳＣＤ１蛋白表達(dá)量也降低（尸＜０．０５，尸＜０．０５）。見圖８。逡逑Ａ邐Ｂ邋ｉ．ｏｎ邐終逡逑ｔＣＺｌ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑■邋Ｍｏｄｅｌ逡逑您邋ＭＳ邋Ｍｉｄｄｌｅ逡逑ｒ逡逑ＣＤ３６／Ａｃｔｉｎ邐ＳＣＤ１／Ａｃｔｉｎ逡逑圖８．脈抒降低高脂血癥金黃地鼠肝臟脂肪酸代謝相關(guān)蛋白ＣＤ３６，邋ＳＣＤｌ的表達(dá)逡逑（ｎ＝５）。Ａ為具有代表性的一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果；Ｂ為Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ蛋白條帶信號(hào)密逡逑度值，每組�。祩�(gè)樣品混合后上樣，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（ｒｉ＝５）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋８．邋Ｍａｉｓｈｕ邋ｒｅｄｕｃｅｓ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄｓ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ－ｒｅｌａｔｅｄ邋ＣＤ３６逡逑ａｎｄ邋ＳＣＤｌ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｌｉｖｅｒｓ邋ｏｆ邋ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ邋ｇｏｌｄｅｎ邋ｈａｍｓｔｅｒｓ．邋Ａ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｓ邋ａｎｄ逡逑ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ邋ｏｆ邋ＣＤ３６邋ａｎｄ邋ＳＣＤｌ．邋Ｂ）邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ±邋ＳＥＭ邋（ｎ＝５）．逡逑＃＾＜０．０５

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2741746